深入了解融合基因，引物設計及載體構(gòu)建案例詳解！
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PMID：19293179，IF：9.13，Cancer Res. 2009 Apr 01;69(7)
PMID：19293179，IF：9.13，Cancer Res. 2009 Apr 01;69(7)
PMID：19293179，IF：9.13，Cancer Res. 2009 Apr 01;69(7)
融合基因引物設計—根據(jù)目的蛋白序列設計引物
以結(jié)核分枝桿菌TB10.4-Hsp16.3為例，需設計兩對，四條引物，P1:TB10.4上游引物，P2:TB10.4下游重疊引物，P3：Hsp16.3上游重疊引物，P4:Hsp16.3下游引物
重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR)由于采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。
此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理。
根據(jù)Genbank報道的Mtb H37Rv株TB10.4和Hsp16.3基因序列設計如下引物：TB10.4上游引物(P1)：GGATCC ATGTCGCAAATCATGTACAACT，TB10.4下游重疊引物 (P2)：GCTTCCACCGCCACC GCCGCCCCATTTG；Hsp16.3上游重疊引物 (P3)：GGTGGCGGTGGAAGC ATGGCCACCACC，Hsp16.3下游引物(P4)：AAGCTT TCAGTTGGTGGACCGGATC。P1含BamH I 酶切位點，P2、P3含互補的接頭序列，P4含Hind III酶切位點。
步驟一：擴增TB10.4及Hsp16.3以Mtb H37Rv基因組DNA為模板，分別以P1和P2、P3和P4為引物對，擴增TB10.4和Hsp16.3基因片段。
擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環(huán)；72℃終止5 min?；厥占兓疶B10.4和Hsp16.3。
以重疊延伸PCR技術(shù)將兩者連接，此時擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共10個循環(huán)；
72℃終止5 min；再加入引物P1、P4，擴增融合基因TB10.4-Hsp16.3，此時擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共32個循環(huán)；72℃終止5min。
第一泳道：約750b的TB10.4-Hsp16.3
部分測序結(jié)果，將測序結(jié)果與GeneBank中基因序列相比。以驗證融合基因序列正確性。
2、pMD-TB10.4-Hsp16.3和pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切
3、純化雙酶切的融合基因TB10.4-Hsp16.3和表達載體pET-28a(+)
4、取酶切的TB10.4-Hsp16.3 與pET-28a(+) 連接
5、轉(zhuǎn)化進E.coli DH5ɑ的感受態(tài)細胞
第一泳道：菌落PCR鑒定TB10.4-Hsp16.3
第二泳道：雙酶切后TB10.4-Hsp16.3及pET-28a(+）
1、制備E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞
2、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細胞
第三、四、五泳道：純化TB10.4-Hsp16.3（29kd）
將純化的TB10.4-Hsp16.3進行12%SDS-PAGE分離；150mA恒流轉(zhuǎn)印2h，轉(zhuǎn)印后的NC膜用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜；分別加1：100稀釋的TB患者陽性混合血清和健康體檢者混合血清，37℃作用2h，PBST洗膜5次；加1：3000稀釋的HRP標記羊抗人IgG，37℃作用2h，PBST洗膜6次；以增強型ECL化學發(fā)光檢測結(jié)果。
1、利用原核表達載體體外細菌大量表達融合蛋白，并利用Ni+-NTA柱純化蛋白，Western-blot法鑒定后Balb／c小鼠體內(nèi)注射免疫小鼠。
2、免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中，并洗滌3次去掉小鼠的血清。
SP2／0細胞是用加有10％胎?；蛐∨Ｑ迮囵B(yǎng)的，每天更換新鮮培養(yǎng)液使成為對數(shù)分裂期生長旺盛的細胞。
細胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細胞合并在同一試管中，用50％的聚乙二醇(相對分子質(zhì)量為1000—1500)作為融合劑，在37℃條件下融合l-2min。然后用1640培養(yǎng)液緩慢稀釋，然后除去PEG，將細胞分散至HAT選擇培養(yǎng)板中。
3、陽性雜交瘤細胞的篩選與單克隆化：雜交細胞經(jīng)約10-14d培養(yǎng)后，形成可用的細胞集落(克隆)。經(jīng)過幾次更換培養(yǎng)液(HT培養(yǎng)液)后進行抗體活性檢測。產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株即擴大培養(yǎng)，以獲得足夠的細胞用于保存和制備可供應用的抗體。
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