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Cell Res | 張恒/鄧增欽/李壯揭示Ago蛋白相關(guān)NADase在細菌免疫中的激活機制

時間：2023-06-20 來源： 瀏覽：

Cell Res | 張恒/鄧增欽/李壯揭示Ago蛋白相關(guān)NADase在細菌免疫中的激活機制

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煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD + ）是細胞周期中的核心代謝物，NAD + 耗竭是存在于原核和真核生物中的免疫機制。 近期，在一些細菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)短的原核Argonaute蛋白（Ago）可以與在同一操縱子中編碼的含NADase結(jié)構(gòu)域（TIR或SIR2）協(xié)作，通過識別靶標核酸來誘導(dǎo)NAD + 耗竭繼而抵抗移動遺傳元件（如噬菌體和質(zhì)粒）的入侵 1,2 。 然而，這種NADase/Ago原核免疫系統(tǒng)的潛在分子機制仍然未知。

2023年6月13日，天津醫(yī)科大學(xué)張恒團隊與中國科學(xué)院武漢病毒所鄧增欽團隊和湖北大學(xué)李壯團隊合作在 Cell Research  雜志發(fā)表了題為“ Structural insights into mechanisms of Argonaute protein-associated NADase activation in bacterial immunity ” 的研究論文。該研究 解析了來自兩個不同系統(tǒng)（TIR / Ago和SIR2 / Ago）的NADase / Ago復(fù)合物不同組裝狀態(tài)下的冷凍電鏡結(jié)構(gòu) ，發(fā)現(xiàn)TIR / Ago系統(tǒng)通過識別結(jié)合target DNA（tDNA）觸發(fā)TIR/Ago復(fù)合物的高階寡聚化，而SIR2/Ago復(fù)合物的異源二聚體狀態(tài)在tDNA結(jié)合后不會改變。并通過體外生化實驗闡明了兩個系統(tǒng)如何識別核酸激活NADase活性的分子機制。 這項工作揭示了Ago蛋白相關(guān)NADase在原核免疫反應(yīng)中的多樣性和相似性。

為了研究TIR-APAZ和Ago蛋白之間的相互作用模式，作者首先從Maribacter polysiphoniae（以下簡稱TIR / Ago復(fù)合物，也稱為SPARTA）中共純化二元復(fù)合物，并在存在guide RNA（gRNA）的情況下測定其冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。 通過體外NAD降解實驗證明，apo TIR/Ago和RNP復(fù)合物中的TIR結(jié)構(gòu)域在催化上無活性，但tDNA結(jié)合可以有效地激活NADase活性。為了闡明激活TIR/Ago復(fù)合物的分子基礎(chǔ)，作者重建了tDNA結(jié)合的四元復(fù)合物，并以2.95 ?的分辨率測定了其冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。TIR/Ago-gRNA-tDNA復(fù)合物顯示出具有四個TIR/Ago異二聚體拷貝的“蝴蝶形”結(jié)構(gòu)，與生化結(jié)果一致，當RNP識別結(jié)合tDNA后可以誘導(dǎo)TIR/Ago 的高階寡聚化。四個TIR/Ago復(fù)合物通過TIR結(jié)構(gòu)域的四聚化形成兩個翅膀區(qū)（wing region）。兩個Ago分子與APAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合成對稱的頭對頭二聚體，形成蝴蝶的翅膀。兩個翅膀及其各自的TIR在結(jié)構(gòu)上是相同的，雖然它們以不對稱的方式組成。 然而，同一翅膀中的兩個TIR/Ago單元采用不同的構(gòu)象，分別稱為 A/A’ 和 B/B’ 單位 （圖1上）。
對于另一種來自 Geobacter sulfurreducens 物種中的NADase/Ago系統(tǒng)（SIR2/Ago），作者以3.0 ?的分辨率解析了SIR2/Ago-gRNA-tDNA四元復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。 與TIR/Ago系統(tǒng)類似，tDNA結(jié)合可以觸發(fā)SIR2/Ago系統(tǒng)的NADase活性。但是SIR2/Ago復(fù)合物在gRNA-tDNA雙鏈存在下不會組裝成高階低聚物，這與TIR/Ago復(fù)合物的高階寡聚化相反。 生化實驗和結(jié)構(gòu)比對證明，SIR2/Ago系統(tǒng)通過識別結(jié)合tDNA使復(fù)合物獲得更開放的構(gòu)象，繼而使SIR2結(jié)構(gòu)域游離于APAZ/Ago結(jié)構(gòu)域并獲得NADase活性 （圖1下）。
圖1 上：TIR/Ago-gRNA-tDNA四元復(fù)合物的四聚狀態(tài)  下：SIR2/Ago-gRNA-tDNA四元復(fù)合物
研究兩種系統(tǒng)NADase活性的激活機制，作者首先通過比較復(fù)合物激活和未激活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)在靶ssDNA結(jié)合后，均有一段loop從gRNA–tDNA雙鏈轉(zhuǎn)移，被重新拉伸并折疊成β鏈，表明該環(huán)可以作為檢測gRNA–tDNA雙鏈形成的傳感器。 該回路被稱為“傳感器回路”。接下來，作者通過體外?-NAD + 降解實驗和蛋白聚集實驗確定了在不同長度下ssDNA存在情況下NADase被激活的情況，發(fā)現(xiàn)兩種系統(tǒng)至少需要15nt長度的ssDNA才可以順利激活，該長度與結(jié)構(gòu)上傳感器回路阻擋的空間位置相符。
圖2 左：TIR/Ago復(fù)合物對不同長度ssDNA的體外?-NAD + 降解實驗  中：TIR/Ago復(fù)合物在不同長度ssDNA存在下聚集情況的Native PAGE  右：SIR2/Ago復(fù)合物對不同長度ssDNA的體外?-NAD + 降解實驗
對于tDNA的識別，兩種系統(tǒng)都利用Ago蛋白PIWI結(jié)構(gòu)域中的保守傳感器回路來檢測，從而啟動TIR或SIR2結(jié)構(gòu)域中NADase活性所需的構(gòu)象變化。但是TIR結(jié)構(gòu)域需要寡聚以形成TIR/Ago系統(tǒng)中的活性口袋，而SIR2結(jié)構(gòu)域通過識別tDNA結(jié)合增加其靈活性來激活。
圖3 TIR/Ago和SIR2/Ago系統(tǒng)的NADase激活機制示意圖
該研究通過解析不同狀態(tài)下TIR / Ago和SIR2 / Ago復(fù)合物的多種冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，結(jié)合生化突變實驗，揭示了短原核Ago/NADase系統(tǒng)在細菌免疫反應(yīng)中的多樣性和保守性特征。 這項工作提供了對短原核Ago/NADase系統(tǒng)的第一個結(jié)構(gòu)理解，也為細菌免疫中Ago和NAD + 耗竭機制的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。
天津醫(yī)科大學(xué)張恒教授、中國科學(xué)院武漢病毒所鄧增欽研究員和湖北大學(xué)李壯副教授是研究論文的共同通訊作者。天津醫(yī)科大學(xué)博士生王梟燊、李徐梓超、于桂梅博士、碩士生張靈靈、湖北大學(xué)碩士生張晨滴以及武漢病毒所博士生王詠是論文的共同第一作者。該工作還得到了南開大學(xué)劉祥副教授和中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與癌癥研究所魏永特聘研究員的大力支持。該項研究獲得國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)院“百人計劃”項目的支持。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41422-023-00839-7
參考文獻：
1 Koopal, B. et al. Short prokaryotic Argonaute systems trigger cell death upon detection of invading DNA. Cell 185 , 1471-1486 e1419, doi:10.1016/j.cell.2022.03.012 (2022).
2 Zaremba, M. et al. Short prokaryotic Argonautes provide defence against incoming mobile genetic elements through NAD(+) depletion. Nat Microbiol 7 , 1857-1869, doi:10.1038/s41564-022-01239-0 (2022).

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