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北京理工大學 | 胥健萍，王穎，李春，周曉宏：微生物細胞工廠中代謝途徑動態(tài)調控策略與網絡構建

時間：2023-02-11 來源：瀏覽：

北京理工大學 | 胥健萍，王穎，李春，周曉宏：微生物細胞工廠中代謝途徑動態(tài)調控策略與網絡構建

原創(chuàng) 胥健萍等化工進展

化工進展

微信號 huagongjinzhan

功能介紹中國化工學會會刊，EI、SCOPUS等收錄，中國科技期刊卓越行動計劃入選期刊，2020版《中文核心期刊概目要覽》化工類第1名

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微生物細胞工廠中代謝途徑動態(tài)調控策略與網絡構建

胥健萍 ¹ ，王穎 ¹ ，李春 ^1,2 ，周曉宏 ¹

¹ 北京理工大學化學與化工學院生物化工研究所，北京 100081； ² 清華大學化學工程系生物化工研究所，北京 100084

● 引用本文： 胥健萍, 王穎, 李春, 等. 微生物細胞工廠中代謝途徑動態(tài)調控策略與網絡構建[J]. 化工進展, 2022, 41(12): 6511-6521.

● DOI： 10.16085/j.issn.1000-6613.2022-0418

文章摘要

微生物細胞工廠生產目標產物時會面臨營養(yǎng)物質消耗、代謝物積累、異源途徑壓力和遺傳不穩(wěn)定等問題，導致代謝失衡，因此需要對細胞代謝途徑重新進行設計，使代謝途徑根據發(fā)酵等環(huán)境條件的變化自動調節(jié)代謝通量，達到高效生產。本文首先介紹了動態(tài)調控元件的主要類型、調控機制及其應用，重點講述了與誘導物或誘導因素作用的蛋白質轉錄因子調控元件和RNA核糖開關調控元件；并且從轉錄因子與啟動子序列兩個方面介紹了動態(tài)調控元件的設計與改造策略；隨后總結了誘導調控元件應用于代謝途徑動態(tài)調控網絡構建的策略，基因表達調控已從單輸入信號調控轉向多輸入信號邏輯門調控，通過多重誘導輸入信號的邏輯門和閉環(huán)代謝物反饋回路構建更精確的動態(tài)調控網絡。

利用微生物細胞工廠實現(xiàn)大宗化學品、生物質能源、天然產物等的合成是解決化石資源日益枯竭、保持可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。近年來，許多微生物細胞工廠被成功開發(fā)并且實現(xiàn)了產業(yè)化應用。在工業(yè)規(guī)模的生產中，許多工程菌株無法在滿足生產速率和產量要求的同時保持穩(wěn)定的性能，因而造成了產業(yè)化的困難。代謝工程致力于解決工程微生物在生產過程中出現(xiàn)的各種問題。外源引入的代謝途徑依賴宿主的核糖核酸（RNA）聚合酶、核糖體、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、輔因子和其他內源代謝物，因此會與宿主細胞競爭資源，造成代謝負擔、輔因子失衡或有毒代謝物的積累等，最終干擾工程微生物的生長和生產。代謝工程的三大要素是滴度、產率和速率，已成為評估工程細胞工廠成本競爭力的基準。傳統(tǒng)代謝工程是靜態(tài)控制系統(tǒng)，許多代謝工程工作致力于篩選高效的酶和增強前體/輔因子供應，通常對目標產物合成中的關鍵基因進行過表達和對旁路途徑相關基因進行敲除，從而將代謝流精準而高效地引入產物合成途徑。這種方法在一定程度上可以提高目標產物的產量，但同時也可能會加劇細胞的代謝負擔，致使代謝流失衡，因此目前需要更精細的動態(tài)調控，發(fā)揮微生物細胞工廠生產的最大潛力。

動態(tài)調控策略來源于大自然中的微生物用來維持體內平衡、協(xié)調代謝流量以及使代謝適應不斷變化的環(huán)境和壓力的代謝調控系統(tǒng)，通過開發(fā)誘導調控元件，對代謝途徑代謝網絡節(jié)點關鍵酶基因進行動態(tài)調控，使微生物響應細胞外環(huán)境及細胞內代謝物濃度變化，實現(xiàn)目標產物的高效生產。動態(tài)調控顯著提高了微生物在不同發(fā)酵條件下的魯棒性，滿足了細胞生長與代謝產物積累期不同的代謝調控需求。

代謝途徑的動態(tài)調控可以協(xié)調細胞的生長和生產，在提高產量的同時盡量避免對菌體的傷害。但是目標化合物的合成往往涉及許多步反應，需要調控的關鍵酶基因和旁路基因眾多，而且細胞內本身的代謝網絡錯綜復雜，要構建更為智能的細胞工廠要求對所有的關鍵代謝節(jié)點進行精確調控，不僅要實現(xiàn)細胞生長與產物積累的分段調控，同時還要在產物合成積累期實現(xiàn)關鍵酶精細適配表達，平衡代謝流，提高底物轉化率和目標產物產量。精確設計的動態(tài)調控網絡可以賦予工程菌株適應不斷變化的環(huán)境并維持代謝穩(wěn)態(tài)的能力（圖1）。隨著合成生物學工具的快速發(fā)展，構建更靈敏、更寬范圍的調控元件，設計、構造和表征更復雜的代謝網絡已成為可能。本文介紹了動態(tài)調控元件類型、調控機制、改造的研究進展，以及誘導調控元件在代謝途徑動態(tài)調控和動態(tài)代謝網絡構建中的應用。

圖1 代謝工程中精確設計的動態(tài)調控網絡

動態(tài)調控元件的主要類型與調控機制

微生物動態(tài)調控是在誘導物、溫度、pH、光等條件下，通過傳感元件感知細胞內外環(huán)境的變化繼而作用于調控元件，對關鍵基因的表達實現(xiàn)適時的開啟、調節(jié)和關閉，從而實現(xiàn)細胞生長與產物合成的分段調控從而實現(xiàn)代謝流的平衡，進而提高底物轉化率和目標產物產量。目前大部分動態(tài)調控研究都是基于傳感元件和調控元件篩選和改造的基礎上進行的，旨在獲得專一性強、調控范圍大、信噪比高、調控精度準的動態(tài)調控體系（表1）。動態(tài)調控體系的構建包含傳感元件和調控元件，傳感元件是與誘導物結合或通過誘導因素作用的生物大分子，應用廣泛的傳感元件有兩大類：蛋白質（如變構轉錄因子）和RNA（如核糖開關）。轉錄因子與誘導物或誘導因素作用、變構后，再作用于調控元件即誘導型啟動子，進行轉錄水平的調控；而核糖開關是傳感元件與調控元件合為一體RNA適體結構，RNA適體與誘導物結合變構后，形成調控元件，以調控基因轉錄的適時終止、成熟mRNA的形成、核糖體結合位點的暴露，這些調控手段分別屬于轉錄、轉錄后及翻譯水平調控。

表1 應用于動態(tài)調控的基因元件

1.1

變構轉錄因子和誘導型啟動子

蛋白質傳感元件變構轉錄因子（allosteric transcription factors，ATF）是種類最多、應用最廣的傳感元件，包括效應物結合結構域（effector-binding domain，EBD）和DNA結合結構域（DNA-binding domain，DBD）。EBD與誘導物分子結合后，引起轉錄因子的構象變化，轉錄因子再通過DBD與相應的調控元件即誘導型啟動子上游的順式作用元件特異性結合，提高或限制RNA聚合酶的作用，促進或抑制基因的轉錄?；贏TF和誘導型啟動子的動態(tài)調控體系一般而言可以分為誘導阻遏型和誘導激活型，調控體系的功能取決于ATF的功能。對于誘導阻遏型ATF，當誘導物存在時，其抑制功能被激活或抑制，從而導致靶基因的非表達或表達[圖2(a)]；而對于誘導激活型ATF，當誘導劑存在時，其激活功能可以被激活或抑制，從而分別導致靶基因的表達或不表達[圖2(b)]。誘導劑可以是與工程菌生長相關的營養(yǎng)源，如葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、氨基酸、有機酸等，也可以是某種次級代謝產物，或是一些金屬離子、激素等。

圖2 基于ATF的動態(tài)調控體系分類

誘導激活型動態(tài)調控體系中，半乳糖調節(jié)系統(tǒng)是一種經典的響應營養(yǎng)源的動態(tài)調控體系，其誘導和抑制受到半乳糖和葡萄糖的嚴格調控，且該體系中GAL1、GAL10啟動子動態(tài)范圍大、啟動子強度高。將半乳糖調控體系用于優(yōu)化 β -胡蘿卜素生物合成途徑，構建了可控且遺傳穩(wěn)定的高產菌株。雖然響應營養(yǎng)源的動態(tài)調控具有諸多優(yōu)點，但這些體系的應用受到限制，如易受其他營養(yǎng)源影響，易被細胞吸收利用，易對其他未知基因的表達形成擾動等，為此，研究者開發(fā)了一些響應非營養(yǎng)源誘導物的調控體系，金屬離子就是其中最重要的一類。Peng等利用銅離子誘導的調控體系優(yōu)化類異戊二烯代謝途徑，在酵母中將倍半萜反式橙花醇產量提高至392mg/L。雌二醇誘導體系是另一種響應非碳源誘導物的調控體系，類固醇激素的激素結合域（hormone binding domain，HBD）與其他調控蛋白的DBD融合后會使融合蛋白受到激素配體的調控，與皰疹病毒的VP16蛋白轉錄激活域（activation domain，AD）進行融合并優(yōu)化，得到了一個人工轉錄激活因子。雌二醇誘導體系的誘導調控機理如圖3所示：β-雌二醇的加入取代了Hsp90，與雌二醇受體（estrogen receptor，ER）結合，提供一個核定位信號，轉錄激活因子轉移到細胞核，Liu等利用β-雌二醇誘導表達系統(tǒng)過表達脂肪酸碳鏈延長循環(huán)中的關鍵酶3-酮?；鵆oA合酶，使釀酒酵母中的神經酸的產量比使用強啟動子PPGK的對照菌株增加了332%。

圖3 雌二醇誘導體系的誘導調控機理

誘導抑制型動態(tài)調控體系中，響應營養(yǎng)源的甲硫氨酸調控體系早些年就在代謝工程領域得到了應用，在β-香樹脂醇的合成途徑中，羊毛甾醇合酶基因 ERG 7是細胞生長必需基因，但是其表達會使代謝流引向羊毛甾醇旁路，為了實現(xiàn) ERG 7的下調，Kirby等用蛋氨酸阻遏啟動子P _MET3 替換天然 ERG 7啟動子，最終將 β -香樹脂醇產量提高了50%。天然的誘導抑制調控體系數量有限，因此有研究者通過轉錄失活策略構建轉錄抑制體系，F(xiàn)apR是一種保守的轉錄阻遏蛋白，但當與一個轉錄激活域（transcriptional activation domain，AD）融合后便得到一個作用相反的轉錄激活因子。在沒有丙二酰CoA時，它可以激活基因的轉錄，當與丙二酰CoA結合時則脫離啟動子，抑制基因的轉錄，形成了丙二酰CoA轉錄抑制型的調控體系。

1.2

誘導型核糖開關

基于變構轉錄因子和誘導型啟動子的調控體系依靠蛋白質與小分子和DNA的互作。而誘導型核糖開關本質是一段短小的RNA序列，這段RNA序列既作為傳感元件也作為調控元件。

人們發(fā)現(xiàn)天然存在的RNA傳感元件可以結合一系列小的代謝物和離子，并對轉錄、翻譯、剪接和RNA穩(wěn)定性進行調控。基于核糖開關的動態(tài)調控體系由RNA適體結構域介導，核糖開關可以：①在轉錄過程中通過抑制抗終止因子和幫助形成終止子調節(jié)轉錄[圖4(a)]；②在轉錄后加工過程中通過核酶的活性位點切割mRNA影響其加工成熟過程[圖4(b)]；③在翻譯過程中通過暴露/隱藏核糖體結合位點（RBS）來調節(jié)翻譯[圖4(c)、(d)]。這種調節(jié)主要是通過適體RNA與配體或代謝物直接結合后構象的變化來實現(xiàn)的。核糖開關根據對目的基因的作用，也可分為激活型和抑制型兩大類。誘導型核糖開關中最典型的代表是茶堿誘導型核糖開關。近25年來，響應茶堿的RNA適體被用于控制細胞運動、調節(jié)碳代謝、構建邏輯門、篩選突變酶和控制細胞凋亡。響應茶堿的核糖開關首次報道于2004年。隨后又陸續(xù)有許多研究者圍繞響應茶堿的RNA適體研究構建不同的核糖開關。例如Gallivan核糖開關、Smolke核糖開關、Ogawa核糖開關等。Zhou等用賴氨酸誘導型核糖開關抑制檸檬酸合成酶基因gltA的表達，以減少乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)的通量，從而將碳通量更多地引入賴氨酸的合成途徑，最終使將賴氨酸產量提高了63%。當前，誘導型核糖開關在代謝工程中被用作生物傳感器來檢測反饋細胞內情況，但是在調控代謝途徑中的應用比較有限。

圖4 基于核糖開關的動態(tài)調控體系分類

動態(tài)調控元件的設計與改造

當前對于動態(tài)調控體系的設計與改造工作主要集中于對變構轉錄因子及誘導型啟動子這兩類元件的改造。核糖開關因其結構穩(wěn)定性差，加之在代謝途徑調控中的應用不多，關于元件性能優(yōu)化的工作鮮有報道。

2.1

針對ATF元件的設計與改造

對于ATF介導的動態(tài)調控體系，動態(tài)調控范圍、操作范圍、靈敏度、本底泄露被視為關鍵因素。適應性進化是ATF設計改造策略中最強勁的手段。該方法利用熒光激活細胞分選技術（fluorescence activated cell sorting， FACS）或其他高通量表型選擇手段，不斷反復對突變菌株施加環(huán)境選擇壓力，借此獲得目標突變體。隨著合成生物學的發(fā)展，針對ATF元件的適應性進化策略也在不斷進步和修正，從最初的構建大規(guī)模突變體文庫逐一篩選逐漸發(fā)展為利用合適的選擇壓力（如抗生素）縮小突變體文庫，減少工作量，近年來更是有研究者將機器學習算法應用于ATF的適應性進化，利用算法預測突變體表型。

Chou等構建了一個稱為反饋調節(jié)表型進化（FREP）的自適應控制系統(tǒng)：提高突變率以在種群中產生多樣性，并隨著目標代謝物濃度的增加而降低突變率。利用該方法成功構建了響應異戊烯基二磷酸的動態(tài)調控體系。FREP策略已成功應用于大腸桿菌，使酪氨酸和IPP的生物合成分別增加了5倍和3倍。

過大的突變體文庫會增加選擇的困難，增加篩選的工作量，降低篩選效率。因此通過高通量篩選目標突變體，希望在少量突變體中獲得性能優(yōu)良的個體。選擇合適的方法、適當增加選擇壓力有助于縮小突變體文庫。Mahr等利用人工選擇壓力，結合響應纈氨酸的轉錄因子（L-valine responsive transcription factor，Lrp）的動態(tài)調控體系和FACS建立了一個適應性實驗室進化系統(tǒng)：進行了5輪迭代進化步驟，每個步驟都通過FACS選擇10%熒光最高的細胞，經過逐輪的篩選，最終使目標突變體文庫縮小至7個突變體，成功使L-纈氨酸產量增加25%，副產品的形成減少了3~4倍。

隨著機器學習算法與合成生物學的交融發(fā)展，已經能利用算法大規(guī)模分析預測元件的功能。Zhou等利用DNA可追蹤組裝方法和熒光激活細胞分選，結合下一代測序（FACS-seq）技術，以大規(guī)模并行方式構建和全面表征2632個ATF介導的傳感調控體系，借此提供動態(tài)調控元件理性設計的數據支持，成功優(yōu)化了響應丙二酰輔酶A的調控元件。應用機器學習算法預測基因型-表型關系，通過特征重要性分析，識別序列插入方案和UAS的選擇對動態(tài)范圍有顯著影響。為生物傳感器響應曲線的設計、調整和分析提供了平臺，促進了基因電路的合理設計。

2.2

針對啟動子元件的設計與改造

啟動子的設計改造是構建啟動子文庫的主要方法，包括隨機突變、雜交啟動子工程和轉錄因子結合位點的理性設計等策略。在過去的幾十年中，啟動子工程策略已經在許多重要的工業(yè)菌株中得到了廣泛的應用，包括大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母、鏈霉菌和乳酸菌等。

易錯PCR是一種簡單的體外隨機突變技術，被認為是獲得DNA序列多樣性的有效方法，突變被隨機插入到整個啟動子區(qū)域的任何位置，可以保證快速構建大規(guī)模啟動子庫。例如，通過Ep-PCR在釀酒酵母中成功生成了誘導氧抑制的DAN1啟動子文庫。然而，Ep-PCR所表現(xiàn)出的突變偏差往往會影響突變文庫啟動子序列的多樣性，過多的錯義突變更是會增加后續(xù)篩選過程的工作量。在啟動子中，非保守區(qū)（non-conserved regions，NCR）不是RNA聚合酶直接結合的區(qū)域，但這些序列可能允許調控蛋白與啟動子的識別和特異性結合，進而改變靶基因的表達水平。因此非保守區(qū)隨機突變是產生不同表達強度啟動子的有效途徑。Wei等基于谷氨酸棒狀桿菌-10區(qū)和-35區(qū)、保守的RBS元件和60個隨機核苷酸設計了一個大型啟動子庫，所獲得的啟動子可以有效地調控基因表達，并在很大范圍內表現(xiàn)出不同的強度。

雜交啟動子工程涉及上游增強子元件和源自幾種不同啟動子的核心區(qū)的組裝。這種策略已被用于提高原核生物和真核生物的轉錄效率或創(chuàng)造新的啟動子。Blazeck等在釀酒酵母中構建了一系列雜交啟動子文庫來實現(xiàn)對酵母的表達調控。上游激活序列（upstream activation sequence，UAS）的串聯(lián)可以作為轉錄水平的放大器。Redden和Alper將酵母啟動子與增強子序列進行雜合，提高了啟動子強度。與天然啟動子相比，雜交啟動子工程可能是獲得更強啟動子的一種有前途和有效的策略。

原核和真核啟動子通常都包含幾個短序列元件，這些基序可以介導特定轉錄因子的結合。轉錄因子對特定結合位點的結合親和力在啟動子強度和調控中起重要作用。Murphy等開發(fā)了一種設計組合啟動子的策略，以研究來自釀酒酵母的GAL1啟動子中tetO2序列位置和數量的影響，結果表明，tetO2位點數量的增加和它們與TATA盒的接近導致了對GAL1啟動子的更強的轉錄抑制。因此，通過直接理性設計轉錄因子結合位點來優(yōu)化啟動子的活性將是啟動子工程的一個很好的選擇。然而，對于特異性轉錄因子的DNA結合位點和親和力的研究尚不充分，使該方法在代謝工程中的進一步應用受到限制。

動態(tài)調控網絡的構建策略與應用

細胞內的代謝途徑相互交織，形成一個復雜的多層次代謝網絡?；衔锏暮铣赏ǔＩ婕岸喾N代謝途徑，它們以級聯(lián)或協(xié)同方式為化合物的合成提供前體和輔因子。因此，代謝網絡的合理布局是微生物細胞工廠的核心問題之一。代謝網絡動態(tài)調控可以分為三個層次（表2）：①基于單一誘導調控元件（基因開關）的動態(tài)調控；②基于邏輯門介導的多重誘導動態(tài)調控；③基于反饋回路的動態(tài)調控。

表2 代謝途徑的動態(tài)調控網絡構建

3.1

基于單一誘導調控元件的動態(tài)調控

傳統(tǒng)代謝途徑構建策略主要通過關鍵酶基因的過表達和旁路途徑分支酶基因的敲除實現(xiàn)，但會造成細胞代謝負擔或細胞生長所需代謝物合成不足，抑制細胞生長，影響目標產物合成，因此需要將細胞生長階段與生產階段分離?？赏ㄟ^引入基因開關，在細胞生長階段，關閉控制目標產物關鍵酶基因表達開關，細胞生長相關基因正常表達，當獲得足夠的生物量時，打開基因開關，關鍵酶基因開啟，目標產物大量合成。Brockman等利用TetR阻遏子和Ptet啟動子開發(fā)了一種開啟型基因開關用于細胞生產階段開啟肌醇合成途徑關鍵酶基因，實現(xiàn)肌醇產量和效價的兩倍提高。Soma等設計了基于LacI和TetR的關閉型基因開關的來控制異丙醇的生產。如圖5(a)所示，一方面在生產階段添加IPTG誘導LacI解除阻遏，從而激活PLlacO1啟動子，開啟異丙醇生產途徑合成關鍵酶基因（ thl A、 atoA D、 adc 、 adh E）的表達；另一方面，IPTG誘導也開啟了TetR的表達，繼而抑制PLtetO1啟動子，下調了旁路途徑關鍵酶基因 glt A的表達，異丙醇滴度提高了3倍以上。Westfall等利用半乳糖誘導型啟動子作為開啟型基因開關，過表達青蒿酸合成途徑中的8個內源基因和2個外源基因，實現(xiàn)了對長代謝途徑中多個基因的控制，如圖5(b)所示，經過發(fā)酵優(yōu)化使青蒿酸的產量達到40g/L。隨后，Xie等利用半乳糖誘導型啟動子和葡萄糖誘導型啟動子順序調控β-胡蘿卜素的生物合成途徑，如圖5(c)所示，其中關鍵代謝節(jié)點法尼烯基焦磷酸（FPP）的上游、下游基因由半乳糖誘導型啟動子調控，競爭途徑基因 ERG 9由葡萄糖誘導型啟動子調控，結合高密度發(fā)酵使產量提升至1156mg/L。

圖5 基因開關在代謝途徑調控中的應用

3.2

基于邏輯門介導的多重誘導動態(tài)調控

使用簡單的單級控制策略很難實現(xiàn)更加精準的動態(tài)控制，因此，合成生物學家通常應用邏輯門的概念來構建更復雜、多層的基因線路，這些線路可以感知多種信號，并將代謝流量引導到目標化合物的合成。2012年，麻省理工學院的Moon等首次將邏輯門的概念應用于生物系統(tǒng)，他們將調控信號整合到遺傳線路中，構建了“與”門調控線路。Taketani等在guide RNA（CRISPR-dCas9）的基礎上構建了一組響應膽汁酸和脫水四環(huán)素的NOT/NOR門。Anderson等將水楊酸誘導啟動子調控的琥珀抑制基因tRNA sup D和阿拉伯糖誘導啟動子調控的T7 RNA聚合酶基因組成一個與門邏輯線路，T7 RNA聚合酶基因包含兩個琥珀終止密碼子（T7ptag）無義突變，在T7 RNA聚合酶基因轉錄后，同時表達琥珀抑制基因tRNA，翻譯出有活性的T7 RNA聚合酶，表達綠色熒光蛋白（圖6），實現(xiàn)與門開啟。

圖6 響應小分子水楊酸和阿拉伯糖的“與”門

Moser等構建并優(yōu)化了大腸桿菌內的三個動態(tài)調控體系以響應葡萄糖、溶解氧和副產物（乙酸鹽）。調控體系分別使用CRISPRi和靶向蛋白質水解在轉錄和翻譯后水平調節(jié)內源酶的表達水平。這項工作為人們演示了如何實現(xiàn)可定制的動態(tài)基因調控。Moon等將兩個和三個2輸入“AND”門連接在一起，分別在細菌中創(chuàng)建一個3輸入和4輸入“AND”門。這4個輸入“AND”門是迄今為止描述的最大的合成基因邏輯線路，可以調控11個蛋白的表達。多種信號的邏輯線路可望將不同代謝途徑耦聯(lián)起來構建代謝網絡，響應不同的代謝物或誘導劑，實現(xiàn)代謝網絡的最優(yōu)調節(jié)，達到目標產物的最大合成，但目前鮮有這方面的應用報道。代謝網絡中應用多個誘導劑時，需要保持誘導劑的高特異性，減少潛在的串擾。

3.3

基于反饋回路的動態(tài)調控

在工業(yè)生產時，如果中間產物累積到毒性水平，將誘導細胞整體應激反應，將潛在有毒中間體的濃度抑制在較低水平是提高生產率的有效策略，模擬自然細胞維持穩(wěn)定內部環(huán)境的負反饋回路機制有望解決這一問題。Dahl等通過引入響應有毒中間體法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的反饋調節(jié)，成功地提高了紫穗槐二烯的產量。他們通過轉錄組學分析研究了大腸桿菌基因組中的FPP響應啟動子，發(fā)現(xiàn)有些啟動子被FPP激活（例如PrstA），有些被FPP抑制（例如PgadE），因此將PrstA用于調控編碼紫穗槐二烯合酶基因的表達，該基因消耗FPP，隨后將PgadE用于調控增加FPP供應的基因（ Mev T和 MBI ），以避免FPP積累，與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，這種雙反饋調節(jié)的方式使紫穗槐二烯的產量提高了2倍。Xu等使用基于FapR的反饋回路來控制丙二酰輔酶A的含量，丙二酰輔酶A作為參與脂肪酸合成的關鍵中間體，與FapR結合后會抑制P _GAP 啟動子，但能激活P _T7 啟動子，將丙二酰輔酶A供應途徑乙酰CoA羧化酶ACC受丙二酰輔酶A抑制型啟動子P _GAP 調控，丙二酰輔酶A消耗途徑脂肪酸合成酶FAS受丙二酰輔酶A激活型啟動子P _T7 調控（圖7），當丙二酰輔酶A增多時，就會抑制其供應途徑和激活其消耗途徑，當丙二酰輔酶A減少時，就會解除其供應途徑抑制和消耗途徑的激活，動態(tài)優(yōu)化脂肪酸合成，使效價增加2倍。Zhou等通過使用賴氨酸抑制型核糖開關構建了一個反饋回路，將谷氨酸棒桿菌中的檸檬酸合成酶基因 glt A置于核糖開關控制之下，當賴氨酸濃度較高時， glt A的表達降低，減少了進入TCA循環(huán)的碳通量，增加了賴氨酸的產量。

圖7 基于FapR的反饋回路用于控制丙二酰輔酶A的供應與消耗

結語與展望

目前，動態(tài)調控元件的篩選表征與改造優(yōu)化工作發(fā)展迅速，調控元件庫將會日益擴大，許多動態(tài)調控策略也已成功應用于微生物細胞工廠構建，并實現(xiàn)了很多高附加值化學品的高效生產。

但當前的動態(tài)調控策略往往只對代謝途徑中一個或少數幾個節(jié)點進行控制，代謝途徑之間很少相互關聯(lián)，不能全局優(yōu)化，這就需要通過基于邏輯門介導的多重誘導動態(tài)調控實現(xiàn)代謝途徑之間的關聯(lián)，同時引入反饋回路，達到代謝途徑的網絡化調控和代謝通量平衡，提高目標產物的轉化率。構建多層代謝途徑動態(tài)調控網絡，需要面對以下幾個難點：①在調控元件方面，需要尋找更廣泛的代謝物響應調控元件，當前可利用的動態(tài)調控元件數量依然十分有限，基于候選分子和天然誘導物之間的結構相似性篩選潛在的生物傳感器是拓寬動態(tài)調控元件文庫的重要方法；其次，需要通過理性設計或高通量篩選優(yōu)化調控元件的性能，隨著機器學習在合成生物學中的應用，高通量篩選結合機器學習算法預測獲取大量數據來輔助理性設計也成為可能。②在動態(tài)調控網絡構建方面，設計、構建多輸入相關聯(lián)的動態(tài)代謝網絡仍有許多不可控因素。異源代謝途徑的引入不僅會增加細胞的負擔，還可能對細胞產生毒性，為了闡明異源途徑和宿主之間的代謝通量關系，許多研究構建了細胞代謝通量分配和相互作用數學模型，獲得多層次、多模塊的細胞模型是指導動態(tài)調控網路構建的重要工具。目前，在動態(tài)調控網絡構建方面已取得了豐富成果，研究者堅信在未來將構建出更加智能、高效、穩(wěn)健的細胞工廠。

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