江南大學(xué) | 代靜新，宋偉，吳靜，等：ZIF-8-戊二醛固定化細(xì)胞生產(chǎn)α-酮戊二酸
江南大學(xué) | 代靜新，宋偉，吳靜，等：ZIF-8-戊二醛固定化細(xì)胞生產(chǎn)α-酮戊二酸
huagongjinzhan
中國化工學(xué)會會刊，EI、SCOPUS等收錄，中國科技期刊卓越行動計(jì)劃入選期刊，2020版《中文核心期刊概目要覽》化工類第1名
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ZIF-8-戊二醛固定化細(xì)胞生產(chǎn) α -酮戊二酸
代靜新 1 ，宋偉 1 ，陳修來 2 ，劉立明 2 ，吳靜 1
1 江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122
● 引用本文： 代靜新, 宋偉, 陳修來, 等. ZIF-8-戊二醛固定化細(xì)胞生產(chǎn) α -酮戊二酸[J]. 化工進(jìn)展, 2022, 41(12): 6522-6530.
● DOI： 10.16085/j.issn.1000-6613.2022-0385
文章摘要
為了提高表達(dá)L-谷氨酸氧化酶（LGOX）重組大腸桿菌的催化穩(wěn)定性，本研究采用了沸石咪唑框架（ZIF-8）涂層和戊二醛（GA）交聯(lián)的組合固定技術(shù)。確定了ZIF-8和GA的工藝參數(shù)以及固定化細(xì)胞的催化性能，并對固定化重組大腸桿菌催化L-谷氨酸生產(chǎn) α -酮戊二酸（ α -KG）的穩(wěn)定性展開了研究。當(dāng)2-甲基咪唑、醋酸鋅和戊二醛的添加量分別為240mmol/L、80mmol/L和50mmol/L時(shí)，固定化細(xì)胞（ E . coli @ZIF-8-GA）的比活性和活性回收率分別達(dá)到33.4U/g和95.83%。結(jié)果表明，在重復(fù)使用10個(gè)批次后， E . coli @ZIF-8-GA轉(zhuǎn)化生產(chǎn) α -酮戊二酸的產(chǎn)量仍能達(dá)到70.03g/L。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞對溫度和pH的耐受性均發(fā)生顯著提高。
L-谷氨酸氧化酶（LGOX）是以FAD為輔酶的一種黃素酶，因其對反應(yīng)底物具有高特異性和高親和力，反應(yīng)條件溫和，從而廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)發(fā)酵及醫(yī)藥等行業(yè)。近年來，通過開展外源表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化、L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶共表達(dá)等研究，拓寬了LGOX在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸中的應(yīng)用。但仍存在一些不足，其中最為突出的是使用全細(xì)胞催化時(shí)穩(wěn)定性較差、難以重復(fù)利用。解決上述問題的方法可以分為兩大類，一類是采用蛋白質(zhì)工程方法對酶進(jìn)行分子改造，另一類是對細(xì)胞或酶進(jìn)行化學(xué)修飾或者固定化。
近年來，越來越多的固定化技術(shù)被用于生物催化途徑，有效地提高了生物催化劑在生產(chǎn)應(yīng)用中的穩(wěn)定性。該技術(shù)通過把游離細(xì)胞或酶通過化學(xué)或物理手段固定在限定空間內(nèi)，以減少外界不良環(huán)境對生物體的影響，使其盡可能保持良好的活性，且能被重復(fù)和連續(xù)使用。如陳孝鵬等以硅藻土為載體，采用聚乙烯亞胺和戊二醛作為交聯(lián)劑固定重組大腸桿菌，催化合成6-氰基-(3 R ,5 R )-二羥基己酸叔丁酯，在填充床式反應(yīng)器中可以連續(xù)反應(yīng)5個(gè)批次，轉(zhuǎn)化570g/L底物，較游離細(xì)胞間歇操作提高了185%。但目前關(guān)于固定化技術(shù)提高LGOX在生物催化過程中的穩(wěn)定性相關(guān)文獻(xiàn)較少，根據(jù)已有報(bào)道，李力等通過使用海藻酸鈉固定含有LGOX的重組大腸桿菌，重復(fù)使用50次，相對酶活依然保持在80%以上。該方法提高了重組大腸桿菌的重復(fù)使用性，但在使用過程中底物添加量較低，使得 α -酮戊二酸的產(chǎn)量無法滿足工業(yè)化需求。因此，選擇合適的固定化載體來提高生物催化劑的催化效率至關(guān)重要。
沸石咪唑骨架（ZIF-8）是近年來興起的一種新型納米材料，適用于生物催化劑的固定化。ZIF-8是由Zn 2+ 與2-甲基咪唑配位形成，具有大孔隙率、優(yōu)異的結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和極低的毒性等優(yōu)點(diǎn)，為生物催化劑提供了保護(hù)，同時(shí)包裹的生物催化劑表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，包括極高的穩(wěn)定性和耐熱性。細(xì)胞和酶可以在溫和條件下被ZIF-8包覆，這對維持其生物活性至關(guān)重要。如Sun等使用ZIF-8包裹酵母細(xì)胞，使得80%以上的酵母細(xì)胞@ZIF-8在純水中存活一個(gè)月以上，相應(yīng)的游離細(xì)胞幾乎全部死亡。此外，戊二醛（GA）被廣泛用作交聯(lián)劑，通過胺基和醛基的縮合反應(yīng)，將酶或細(xì)胞固定在含有伯胺基的載體上，形成穩(wěn)定的仲醛二胺。綜上所述，固定化技術(shù)可以極大地提高細(xì)胞或酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。如能有效提高固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn) α -酮戊二酸的穩(wěn)定性及催化效率，降低工藝操作成本，將極大促進(jìn)固定化技術(shù)在生物催化領(lǐng)域的深入研究和廣泛應(yīng)用。
本文報(bào)道了一種將ZIF-8和GA結(jié)合的組合固定化策略，在ZIF-8的前體溶液中加入重組大腸桿菌和戊二醛交聯(lián)劑，通過共沉淀法進(jìn)行固定化細(xì)胞的制備，與常用的固定化細(xì)胞方法展開了對比。確定了 E . coli @ZIF-8-GA的工藝條件，并對其開展了表征分析以及催化性能的探究。此外，還探索了ZIF-8應(yīng)用于固定化LGOX酶的可行性，優(yōu)化了固定化酶的制備方法，研究了固定化酶的穩(wěn)定性，為LGOX工業(yè)化應(yīng)用提供了可能性。
1
材料和方法
1.1
主要材料與菌株
α -酮戊二酸（＞95%，Sigma公司）、戊二醛、聚乙烯醇、瓊脂、海藻酸鈉、硅藻土、活性炭、羅丹明B、硫氰化鉀滴定液（國藥集團(tuán)）、7-氨基放線菌素、L-谷氨酸鈉、2-甲基咪唑、乙酸鋅、聚天冬氨酸（＞95%，阿拉丁試劑有限公司）。
實(shí)驗(yàn)菌株BL21(DE3)/pET28a-LGOX由本文作者課題組實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。
1.2
儀器
流式細(xì)胞儀，Accuri C6 Plus，美國碧迪公司；X-射線衍射儀，D8，德國布魯克公司；傅里葉紅外光譜，TENSOR Ⅱ，德國布魯克公司；X-射線電子能譜儀，Axis supra，英國Kratos公司；掃描電子顯微鏡，Quanta 200，美國賽默飛公司；多功能酶標(biāo)儀，H1，美國BIOTEK公司；高壓細(xì)胞破碎機(jī)，UH-06，上海永聯(lián)生物科技有限公司；高速離心機(jī)，5804R，德國艾本德公司。
1 .3
實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 固定化細(xì)胞的制備
海藻酸鈉、聚乙烯醇、瓊脂的固定化方法見參考文獻(xiàn)。
硅藻土-戊二醛：取0.5g濕細(xì)胞溶于10mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中（pH 7，0.1mol/L）配成菌懸液。先加入0.3g硅藻土，攪拌30min；然后加入50mmol/L戊二醛，攪拌30min；過濾回收。
活性炭-戊二醛：取1.5g活性炭于10mL PBS中，加入0.5g濕細(xì)胞，攪拌20min；隨后加入50mmol/L的戊二醛溶液，攪拌10min；過濾回收。
ZIF-8：取240mmol/L的2-甲基咪唑溶于10mL去離子水，用乙酸調(diào)至pH=7.0。將0.5g濕細(xì)胞溶于2-甲基咪唑溶液中，攪拌10min；之后加入10mL的乙酸鋅（80mmol/L）溶液，靜置30min；過濾回收。
ZIF-8-戊二醛：取240mmol/L的2-甲基咪唑溶于10mL去離子水，用乙酸調(diào)至pH=7.0。將0.5g濕細(xì)胞溶于2-甲基咪唑溶液中，攪拌10min；加入50mmol/L的戊二醛溶液，攪拌10min；之后加入10mL的乙酸鋅（80mmol/L）溶液，靜置30min；過濾回收。
1.3.2 固定化細(xì)胞分析方法
固定化細(xì)胞進(jìn)行 α -酮戊二酸轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：稱取20g/L的游離細(xì)胞以及相對應(yīng)的固定化細(xì)胞溶于PBS中（pH 7、0.1mol/L），加入100g/L L-谷氨酸鈉，轉(zhuǎn)化時(shí)間16h、溫度30℃。
α-酮戊二酸的高效液相色譜檢測方法如下。
樣品的處理：取轉(zhuǎn)化液1mL，12000r/min離心10min，將上清液稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，經(jīng)過0.22μm濾膜過濾后供液相色譜分析。
流動相配制：取275μL濃硫酸于900mL超純水中，并用超純水定容至1L，稀硫酸流動相終濃度為5mmol/L。
α-酮戊二酸的測定：采用液相色譜柱（Aminex HPX-87H，300×7.8mm）；流動相流速為0.6mL/min；柱溫35℃，檢測波長210nm。
固定化細(xì)胞LGOX酶活測定根據(jù)已報(bào)道的參考文獻(xiàn),1，做了一定修改。方法如下：LGOX酶活性測定通過Trinder反應(yīng)（4-氨基安替比林體系）測定，反應(yīng)體系中包含：121.4μL/mL 4-氨基安替比林1.0mL，0.26μL/mL N , N -二甲基苯胺1.4mL，60U/L過氧化物酶0.1mL，11mg/mL L-谷氨酸0.5mL。添加適量固定化細(xì)胞后精確反應(yīng)10min，過濾取上清液。在550nm下測定吸光值。LGOX酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol H 2 O 2 所需的酶量即為1U的酶活，用式(1)計(jì)算。
式中， A 550 為550nm下吸光值；14.3為每毫摩爾（mmol）亞胺物質(zhì)的吸光值；3.0為反應(yīng)體系總體積，mL；10為反應(yīng)時(shí)間，min。本文用LGOX的酶活性表示固定化細(xì)胞的活性。
固定化細(xì)胞的比活力、活性回收率用式(2)、式(3)計(jì)算。
式中， A i 為固定化細(xì)胞中LGOX的酶活； A s 為游離細(xì)胞在固定化前LGOX的酶活； m i 為添加的固定化細(xì)胞干重，g。
重復(fù)批次中鋅離子檢測實(shí)驗(yàn)：于10mL試管中，依次加入100μL的Zn(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL）或不同批次轉(zhuǎn)化后的上清液、1.3mL的2mol/L硫氰化鉀（KSCN）溶液、1.2mL乙酸-乙酸鈉（HAc-NaAc）溶液（pH=5.5）和0.8mL的0.1g/L羅丹明B（RhB）溶液，用超純水定容至5mL，反應(yīng)時(shí)間5min。以超純水為空白對照，取適量試液在最大波長555nm處分別測定其吸光度 A 555 nm。
1.3.3 固定化細(xì)胞的表征方法
樣品的干燥：游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞用pH 7.0、100mmol/L PBS緩沖液洗滌，在體積分?jǐn)?shù)2% GA中保存8h，以固定樣品。然后，用100mmol/L PBS緩沖液清洗樣品以去除GA，在50%~90%的乙醇溶液中逐級脫水20min。脫水后自然晾干至恒重。
樣品的染色：游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞用pH 7.0、100mmol/L PBS緩沖液洗滌3次，加入7-氨基放線菌素或碘化丙啶10μL，避光染色20min，之后使用PBS緩沖液清洗3次，用于流式細(xì)胞儀檢測。
檢測方法：使用流式細(xì)胞儀分析材料對細(xì)胞活性的影響。使用傅里葉紅外光譜分析結(jié)構(gòu)組成，掃描范圍為400～3000cm -1 。使用X-射線衍射對樣品定性分析，掃描范圍為5°～40°，掃描時(shí)間為0.02s。使用X-射線電子能譜圖分析樣品的元素組成。使用掃描電鏡分析樣品形貌。
1.3.4 固定化酶的制備
將2mg的LGOX（0.04 U）分散到1mL不同濃度的聚天冬氨酸（PASP）水溶液（1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和50mg/mL）。然后將溶液攪拌10s，然后依次加入2mL 2-甲基咪唑溶液（240mmol/L）和2mL乙酸鋅溶液（40mmol/L）。將混合物靜置4h，離心3次以去除松散吸附的蛋白質(zhì)。此外，將1mL PASP溶液替換為1mL去離子水，并將形成的復(fù)合材料用作對照。
1.3.5 固定化酶的檢測方法
酶濃度測定：采用考馬斯亮藍(lán)法測定酶濃度。配制不同濃度的牛血清蛋白，測定樣品在595nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取10μL樣品，加入300μL考馬斯亮藍(lán)G250染色液，混勻后放置5~10min，根據(jù)測得的吸光值，計(jì)算樣品酶濃度。吸附率計(jì)算公式見式(4)。
式中， W 1 表示固定化前上清液酶濃度； W 2 表示固定化后上清液酶濃度。
1.3.6 固定化酶催化耐久性實(shí)驗(yàn)
固定化LGOX酶進(jìn)行 α -KG轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：稱 取20g/L固定化酶溶于100mL PBS中（pH 7、0.1mol/L），分別加入1mL過氧化氫酶和100g/L L-谷氨酸鈉，轉(zhuǎn)化時(shí)間16h，溫度30℃。反應(yīng)后離心收集固定化酶，pH 7.0、100mmol/LPBS緩沖液洗滌3次，測量固定化酶的酶活性。相對活性計(jì)算公式見式(5)。
式中， W 3 表示反應(yīng)前酶的活性； W 4 表示反應(yīng)后酶的活性。
固定化酶的LGOX酶活測定與固定化細(xì)胞（1.3.2節(jié)）相同。
游離酶LGOX的酶活測定見參考文獻(xiàn)。
2
結(jié)果與討論
2.1
不同載體對固定化細(xì)胞活性的影響
6種不同固體化材料（ZIF-8-GA、聚乙烯醇、瓊脂、海藻酸鈉、硅藻土-GA、活性炭-GA）對細(xì)胞活性的影響如圖1所示。游離細(xì)胞比活性為46.20U/g，通過海藻酸鈉、瓊脂和聚乙烯醇等包埋法固定細(xì)胞的比活性分別是20.40U/g、21.20U/g和23.10U/g，活性回收率分別為67.23%、63.11%、54.29%。這是由于聚乙烯醇、海藻酸鈉和瓊脂將細(xì)胞包裹在其中，增加了細(xì)胞與底物的接觸難度。硅藻土和活性炭通過與GA交聯(lián)-吸附后固定化細(xì)胞的比活性僅9.80U/g和10.60U/g，活性回收率均低于20%。這是由于硅藻土和活性炭的物理吸附力較弱。相比之下，ZIF-8固定化細(xì)胞的整體效果較好，比活性和活性回收率分別為30.11U/g和85.27%。因?yàn)閆IF-8本身具有大孔隙率，覆蓋于細(xì)胞表面后并未影響細(xì)胞的活性。同時(shí)通過細(xì)胞與GA的結(jié)合進(jìn)一步提高了細(xì)胞的活性回收率，ZIF-8-GA固定化細(xì)胞的比活性和活性回收率分別達(dá)到33.40U/g和95.83%。
圖1 不同載體對細(xì)胞的比活力和活性回收率的影響
2.2
ZIF-8-GA添加量對固定化細(xì)胞活性的影響
不同濃度的2-甲基咪唑?qū)Ρ然盍突钚曰厥章实挠绊懭鐖D2(a)所示。隨著2-甲基咪唑濃度的逐漸增加（80~240mmol/L），固定化細(xì)胞的活性逐漸增加，在添加量為240mmol/L時(shí)固定化細(xì)胞的比活力和活性回收率達(dá)到最高值33.1U/g和88.75%，而繼續(xù)增加2-甲基咪唑的濃度（≥240mmol/L）則導(dǎo)致比活力和活性回收率逐漸降低。這是因?yàn)楦邼舛鹊?-甲基咪唑會導(dǎo)致酶失活，從而影響細(xì)胞活性。當(dāng)乙酸鋅濃度達(dá)到80mmol/L，形成的ZIF-8效果最好，比活力和活性回收率分別達(dá)到33.27U/g和88.34%[圖2(b)]。此外，戊二醛濃度為50mmol/L時(shí)，比活力和活性回收率分別34.08U/g和95.83%[圖2(c)]。由于戊二醛對細(xì)胞具有一定毒性，繼續(xù)增加濃度，則會影響固定化細(xì)胞的活性。
圖2 固定化參數(shù)的優(yōu)化
2.3
固定化載體的表征分析
2.3.1 X-射線衍射儀和能譜儀觀察固定化細(xì)胞
E . coli @ZIF-8-GA的固定化原理是通過原位合成的方式將ZIF-8涂層于細(xì)胞表面，并通過戊二醛與細(xì)胞膜上的氨基交聯(lián)達(dá)到固定的目的。為了驗(yàn)證ZIF-8是否可以涂層于細(xì)胞表面，對固定化細(xì)胞進(jìn)行了表征分析。粉末X-射線衍射儀（PXRD）檢測結(jié)果顯示，ZIF-8包裹的細(xì)胞在2 θ =7.3°、10.5°、12.5°、14.6°、17.9°、25.5°、26.4°、29.4°處觀察到衍射峰[圖3(a)]，與ZIF-8的標(biāo)準(zhǔn)PXRD圖譜基本一致，表明ZIF-8與細(xì)胞的成功結(jié)合。之后通過X-射線能譜儀在固定化細(xì)胞中檢測到Zn元素存在[圖3(b)]，進(jìn)一步證實(shí)了ZIF-8的存在。
圖3 固定化細(xì)胞PXRD圖和X-射線能譜圖
2.3.2 傅里葉紅外光譜儀觀察固定化細(xì)胞
由圖4可得，采用傅里葉紅外光譜（FTIR）對預(yù)合成的材料與固定化細(xì)胞進(jìn)行完整性檢測。觀察到在420cm -1 出現(xiàn)ZIF-8中具有代表性的Zn—N鍵的伸縮振動吸收峰，在688cm -1 和758cm -1 處出現(xiàn)咪唑環(huán)的平面外彎曲特異吸收峰，在953cm -1 和1308cm -1 處出現(xiàn)咪唑環(huán)的平面內(nèi)彎曲特異吸收峰，這些特異吸收峰與文獻(xiàn)中報(bào)道的ZIF-8的特異吸收峰基本一致。從官能團(tuán)方面證明了固定化細(xì)胞的成功制備。
圖4 固定化細(xì)胞的紅外譜圖
2.3.3 掃描電鏡觀察固定化細(xì)胞的形態(tài)
使用掃描電鏡（SEM）對固定化細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察。由圖5(b)對比可得，固定化細(xì)胞表面沉積有ZIF-8保護(hù)殼。此外，游離細(xì)胞分布均勻[圖5(a)]，在經(jīng)過ZIF-8涂層和戊二醛交聯(lián)之后，固定化細(xì)胞發(fā)生明顯的聚集[圖5(b)]，這有利于固定化細(xì)胞的重復(fù)利用。
圖5 游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的掃描電鏡圖譜
2.4
固定化細(xì)胞的催化性能
2.4.1 溫度的變化對固定化細(xì)胞的影響
溫度（20~50℃）對游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞比活性的影響如圖6(a)所示。隨著溫度的升高，游離細(xì)胞和固定細(xì)胞的比活力于30℃時(shí)達(dá)到最高值35.1U/g和32.9U/g。繼續(xù)升高溫度（≥35℃），固定化細(xì)胞的比活性明顯高于游離細(xì)胞。不同溫度下將固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞孵育16h，測定剩余活性（16h）。由圖6(b)可得，30°C時(shí)固定化細(xì)胞的剩余活性保持在80%以上，游離細(xì)胞的剩余活性僅為55%。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，游離細(xì)胞的活性明顯下降，16h后固定化細(xì)胞的剩余活性比游離細(xì)胞高出40%。這是由于ZIF-8本身具有良好的熱穩(wěn)定性，涂層于細(xì)胞表面后提高了固定化細(xì)胞的耐熱性。
圖6 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的最適溫度和耐熱性
2.4.2 pH的變化對固定化細(xì)胞的影響
pH變化（5.0~9.0）對游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞比活性的影響如圖7(a)所示。固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞最適pH均是7.0，比活力達(dá)到36.2U/g和33 U/g。而提高溶液的pH時(shí)，游離酶比活力迅速下降，而固定化細(xì)胞下降速度相對平緩，顯示出比游離細(xì)胞更寬泛的pH適應(yīng)性。圖7(b)結(jié)果表明，在最適pH條件下，固定化細(xì)胞剩余活性保持在80%以上，游離細(xì)胞僅有50%。當(dāng)pH為9.0時(shí)，固定化細(xì)胞的剩余活性保持在40%以上，而游離細(xì)胞則不到20%。當(dāng)pH為5時(shí)，固定化細(xì)胞的活性發(fā)生明顯下降，這是因?yàn)閆IF-8會在酸性條件下不穩(wěn)定，從而失去了對細(xì)胞的保護(hù)。
圖7 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的最適pH和pH耐受性
2.4.3 操作穩(wěn)定性
為了探索固定化細(xì)胞的工業(yè)應(yīng)用潛力，利用固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞進(jìn)行α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。由圖8(a)可得，當(dāng)游離細(xì)胞使用至第三批次時(shí)產(chǎn)量僅有50g/L，5批次后，催化能力基本喪失。而固定化細(xì)胞在前6個(gè)轉(zhuǎn)化批次產(chǎn)量保持在90g/L以上，重復(fù)使用至第10個(gè)批次時(shí)，產(chǎn)量為70.03g/L。相較于游離細(xì)胞，固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性和催化效率發(fā)生了明顯的提升，進(jìn)一步提高了含LGOX的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸的工業(yè)化潛力。此外，為了觀察在重復(fù)批次過程中ZIF-8的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，反應(yīng)結(jié)束后通過Zn(Ⅱ)-SCN-RhB顯色反應(yīng)體系檢測上清液中是否含有Zn(Ⅱ)，若反應(yīng)液中存在Zn(Ⅱ)，會使得體系的吸收峰發(fā)生明顯下降。這是因?yàn)樵趐H=5.5的HAc-NaAc緩沖溶液和KSCN溶液中，RhB溶液在555nm處有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰。Zn(Ⅱ)和SCN 2- 形成的Zn(SCN) 4 2- 與RhB在靜電引力的作用下結(jié)合成離子締合物，會使體系在555nm處的吸光度隨之減少。由圖8(b)可得，空白對照的 A 550nm =2.196，當(dāng)加入Zn(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL）后， A 550nm 下降至1.147。而在固定化細(xì)胞的連續(xù)操作過程中，檢測反應(yīng)結(jié)束后上清液的Zn(Ⅱ)含量，發(fā)現(xiàn) A 550nm 均保持在2.150左右，說明上清液中并未存在Zn(Ⅱ)，即反應(yīng)過程中并未有金屬離子的泄露。
圖8 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的操作穩(wěn)定性
2.4.4 儲藏穩(wěn)定性
固定化細(xì)胞的儲藏穩(wěn)定性也是其工業(yè)化應(yīng)用的一項(xiàng)重要指標(biāo)。將固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞置于4℃保存，觀察14天內(nèi)細(xì)胞活性的變化。由圖9可得，固定化細(xì)胞在前7天的活性仍能保持在80%左右，相應(yīng)的游離細(xì)胞活性則低于50%。固定化細(xì)胞儲藏至14天時(shí)仍能維持60%的活性，而游離細(xì)胞的剩余活性則幾乎檢測不到。
圖9 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的儲藏穩(wěn)定性
2.5
ZIF-8固定化LGOX酶
2.5.1 聚天冬氨酸的添加量對固定化酶活性的影響
近年來，越來越多的金屬有機(jī)框架用于酶的固定化，所形成的固定化酶具有良好的穩(wěn)定性且便于重復(fù)利用。本研究在使用ZIF-8對LGOX進(jìn)行固定化時(shí)，通過對比分析固定前后上清液酶含量，發(fā)現(xiàn)固定化酶的酶吸（PASP）增加ZIF-8對酶LGOX的吸附量，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)PASP的添加量為15mg/mL時(shí)，固定化酶的吸附率和相對活性分別達(dá)到90%和85%，見圖10。其原因是PASP修飾的LGOX一方面可以遮蓋酶表面的正電荷（通過靜電作用），另外PASP表面大量羧基能促進(jìn)LGOX-ZIF-8復(fù)合物的形成。此外，繼續(xù)增加PASP的濃度，會發(fā)現(xiàn)活性發(fā)生明顯下降。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，推測聚天冬氨酸的加入可能會誘導(dǎo)ZIF-8構(gòu)型的變化，從而影響固定化酶的活性。
圖10 PASP的添加對固定化酶吸附率和活性的影響
2.5.2 PASP-ZIF-8的保護(hù)效果和催化耐久性
為了評估PASP-ZIF-8對酶LGOX的保護(hù)效果，分別將游離酶和固定化酶暴露于胰蛋白酶（5mg/mL）、尿素（5mol/L）和高溫（60℃）等條件下，60min后檢測游離酶和固定化酶的活性[圖11(a)]，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過胰蛋白酶、尿素、高溫處理后游離酶的相對活性僅為27%、19%、16%，而固定化酶相對活性為87%、74%、81%。進(jìn)一步對LGOX@PASP-ZIF-8的催化耐久性進(jìn)行了分析，固定化酶很容易通過離心被回收，檢測重復(fù)試驗(yàn)中的酶泄漏量均不超過1%[圖11(b)]。而重復(fù)使用10個(gè)批次，固定化酶的相對活性始終保持90%以上[圖11(c)]。由此可見，使用PASP-ZIF-8包裹酶更有利于活性的保存，該固定化策略也提高了酶催化生產(chǎn) α -酮戊二酸的應(yīng)用潛力。
圖11 ZIF-8對LGOX的保護(hù)效果和固定化酶的操作穩(wěn)定性
3
結(jié)論
（1）本研究設(shè)計(jì)的ZIF-8-GA載體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且機(jī)械強(qiáng)度較高，給予含LGOX的重組大腸桿菌有效地保護(hù)，顯著增強(qiáng)了全細(xì)胞催化劑的穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過FTIR、PXRD和SEM檢測證明ZIF-8-GA與細(xì)胞的正確結(jié)合。
（2）在一定的溫度（20~50℃）)和pH（5.0~9.0）范圍內(nèi)， E . coli @ZIF-8-GA均顯示出比游離細(xì)胞更好的穩(wěn)定性，同時(shí)固定化細(xì)胞在4℃具有更好的儲藏穩(wěn)定性，表明 E . coli @ZIF-8-GA相較于游離細(xì)胞具有更為寬廣的適用范圍。
（3）在最優(yōu)條件下（30℃、pH 7.0）， E . coli @ZIF-8-GA可重復(fù)催化100g/L L-谷氨酸10批次， α -酮戊二酸產(chǎn)量≥70g/L，解決了表達(dá)LGOX的重組大腸桿菌在全細(xì)胞催化過程中穩(wěn)定性較差的問題；并在連續(xù)操作過程中，未發(fā)現(xiàn)金屬離子的泄露，說明ZIF-8保持了良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
（4）通過引入聚天冬氨酸，提高了固定化酶的吸附率，并對LGOX提供了良好的保護(hù)作用。同時(shí)，固定化酶LGOX@PASP-ZIF-8具有良好的催化耐久性，為進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
作者簡介 ● ●
第一作者：代靜新 ，碩士研究生，研究方向?yàn)橹扑幑こ獭?
通信作者：吳靜 ，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。
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