逆轉(zhuǎn)座子是一類可以通過“復(fù)制-粘貼”的方式在基因組上發(fā)生跳躍的DNA元件。 R2是低等真核生物中廣泛存在的一種逆轉(zhuǎn)座子。它們專一性地“寄生”在宿主基因組的28S核糖體DNA中，借助宿主基因的啟動子，合成自身的mRNA和蛋白質(zhì)并組裝形成R2復(fù)合物（“復(fù)制”過程）；R2復(fù)合物可再次識別宿主28S核糖體DNA上的專一性位點，通過核酸酶（Endonuclease, EN）結(jié)構(gòu)域切開DNA雙鏈，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase, RT）結(jié)構(gòu)域逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將R2基因序列重新整合到宿主基因組上（“粘貼”過程），完成“增殖”。

有趣的是，逆轉(zhuǎn)座子等可移動的DNA元件在基因組上跳躍的過程中，極大地豐富了基因組的組成，被認(rèn)為在基因組進化的過程中扮演著重要的作用。 因此，理解逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的分子機制將有助于思考“我們的基因組從哪里來、如何來”的問題。 此外，利用逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的性質(zhì)，開發(fā)新的核酸操縱工具，將具有巨大的應(yīng)用前景 （ Science ， 2023）。

圖1. 逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的示意圖

研究團隊發(fā)現(xiàn), 位于R2 mRNA 3’端非翻譯區(qū)的RNA（3’-RNA）在R2蛋白質(zhì)切割DNA雙鏈的過程中，表現(xiàn)出促進第一條鏈切割、抑制第二條鏈切割的作用 ；位于5’端翻譯區(qū)的RNA（5’-RNA）則表現(xiàn)出降低第一條鏈切割、激活第二條鏈切割的作用；而當(dāng)5’-RNA與3’-RNA同時存在時，總是表現(xiàn)出3’-RNA的調(diào)控作用，并且完全抑制第二條鏈的切割。 為了進一步理解其中的分子機制，研究團隊解析了R2逆轉(zhuǎn)座子在3’-RNA結(jié)合狀態(tài)和5’-RNA結(jié)合狀態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)。 在3’-RNA結(jié)合狀態(tài)中，DNA底物被蛋白質(zhì)特異性識別，3’-RNA核心區(qū)域結(jié)合在RNA結(jié)合（RNA binding, RB）結(jié)構(gòu)域上。在5’-RNA結(jié)合狀態(tài)中，5’-RNA呈現(xiàn)出復(fù)雜的“三爪（three-claw）”結(jié)構(gòu)，緊密的包裹住蛋白質(zhì)核心。 值得注意的是，5’-RNA的其中一個爪（Claw3）同樣結(jié)合在RB結(jié)構(gòu)域上，且生化分析表明，Claw3對激活第二條鏈切割是必要的。

圖2. 3’-RNA結(jié)合狀態(tài)（左）和5’-RNA結(jié)合狀態(tài)（右）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)

此外，研究團隊用一段連接序列將5’-RNA與3’-RNA連接成一條RNA，設(shè)計了R2全長mRNA的模擬物（L-RNA），并獲得了R2逆轉(zhuǎn)座子在L-RNA結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。 在這個結(jié)構(gòu)中，5’-RNA同樣以“三爪”的形式與蛋白質(zhì)核心緊密結(jié)合，但由于3’-RNA的擠占，起激活第二條鏈切割作用的Claw3未能與RB結(jié)構(gòu)域結(jié)合。研究團隊發(fā)現(xiàn)， L-RNA中3’-RNA與蛋白質(zhì)RB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合將抑制第二條鏈的切割，但當(dāng)提供dNTP作為原料，使逆轉(zhuǎn)錄可以發(fā)生后，3’-RNA在作為逆轉(zhuǎn)錄模板的過程中逐漸從RB結(jié)構(gòu)域上解離下來，5’-RNA得以與RB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活第二條鏈的切割。

圖3. L-RNA結(jié)合狀態(tài)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)與RNA監(jiān)督DNA雙鏈順序性切割的示意圖

綜合以上分析，研究團隊總結(jié)得出了R2逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的分子機制：R2蛋白質(zhì)特異性識別28S核糖體DNA序列后，蛋白質(zhì)RB結(jié)構(gòu)域首先結(jié)合R2 mRNA上的3’-RNA，促進第一條DNA鏈的切割，同時抑制第二條鏈的切割，僅暴露出第一條鏈的3’-OH作為引物，從mRNA的3’端起始逆轉(zhuǎn)錄過程（Targte primed reverse transcription, TPRT），隨著逆轉(zhuǎn)錄的進行，位于mRNA 3’端的3’-RNA逐漸從蛋白質(zhì)RB結(jié)構(gòu)域解離，對第二條鏈切割的抑制作用得以釋放，R2 mRNA上的5’-RNA與RB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合進一步激活了第二條鏈的切割。由此，位于mRNA兩端的結(jié)構(gòu)性RNA共同監(jiān)督了DNA雙鏈切割的順序性切割。 這種嚴(yán)密的順序性切割保障了依賴宿主基因表達元件的R2逆轉(zhuǎn)座子進行“有效的增殖”，在28S核糖體DNA中不斷產(chǎn)生有活性的拷貝。

圖4. R2逆轉(zhuǎn)座子在基因組上發(fā)生跳躍的分子機制與意義

有趣的是，研究團隊將低等真核生物的R2逆轉(zhuǎn)座子與其祖先（原核生物第二類內(nèi)含子，Group II intron）和哺乳動物中的LINE-1逆轉(zhuǎn)座子進行了比較，發(fā)現(xiàn)在Group II intron向R2逆轉(zhuǎn)座子及進一步向LINE-1逆轉(zhuǎn)座子進化的過程中，RNA的結(jié)構(gòu)性組分逐漸減少并被編碼區(qū)域所取代，并且催化功能逐漸從以RNA為主導(dǎo)過渡到以蛋白質(zhì)為主導(dǎo)，為理解生物大分子進化提供了新的視角。此外，LINE-1在哺乳動物基因組中廣泛存在且具有逆轉(zhuǎn)座活性，為基因組提供進化驅(qū)動力的同時，也為基因組穩(wěn)定性和基因表達帶來了重大的影響。 對R2逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的分子機制的研究，將啟發(fā)我們思考LINE-1逆轉(zhuǎn)座子這類“自私的基因”與基因組之間精彩的博弈過程。

圖5. 逆轉(zhuǎn)座子中RNA與蛋白質(zhì)共進化趨勢的示意圖

清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰助理教授和王家副研究員為該文共同通訊作者；清華大學(xué)生命學(xué)院博士后鄧譜涓和博士生譚順青為該文共同第一作者。此外，該項研究工作得到了中國科學(xué)院動物研究所王皓毅研究員、清華大學(xué)生命學(xué)院張強鋒副教授、吝易助理教授等合作者的大力支持。美國Broad研究所張鋒教授和Max E. Wilkinson博士在原子模型搭建中提供了寶貴的建議。

清華大學(xué)劉俊杰團隊長期關(guān)注DNA和RNA核酸酶研究及相關(guān)核酸操縱工具的開發(fā)和應(yīng)用。綜合運用生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)手段，劉俊杰團隊及合作者已鑒定并開發(fā)了多種新型基因編輯工具（ Nature , 2019； Mol. Cell , 2022； Cell Res ., 2023），歡迎對基因編輯或RNA生物學(xué)感興趣，尤其是有細(xì)胞生物學(xué)或生物信息學(xué)等學(xué)科背景的同學(xué)加入劉俊杰團隊。

實驗室網(wǎng)頁

http://gogolab.life.tsinghua.edu.cn

參考消息：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00584-6#%20

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