專論與綜述中國釀造2009年第2期總第203期基因工程菌在木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇中的應用王敏(河北衡水學院生命科學系,河北衡水053000要:利用基因工程技術(shù)對大腸桿菌( Escherichia coi、運動發(fā)酵假單胞菌(2 Zymomonas mobilis、啤酒酵母菌( Saccharomyces cere-進行改造,構(gòu)建出一系列能夠發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物(木糖、葡萄糖)的基因重組菌株,以提高發(fā)酵木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化乙醇的能力,成為目前研究和開發(fā)的重點。文中對其研究進展及相關(guān)菌株載體的構(gòu)建方法進行了綜述關(guān)鍵詞:基因工程;木質(zhì)纖維素;木糖;葡萄糖;基因重組;乙醇中圖分類號:TS26文獻標識碼:A文章編號:02545071(2009)020011-03Application of genetically engineered microbial strains in fuel ethanol production from lignocelluloseWANG Min(Department of Life Science, Hengshui University, Hengshui 053000, China)Abstract: Using Escherichia coli, Zymomonas mobilis, or Saccharomyces cerevisiae as original strain, a series of gene recombination strains whichcan ferment lignocellulose hydrolysis(xylose and glucose) were constructed by genetic engineering technology. How to improve the fermentation ca-pability of recombinant strains to produce ethanol from xylose and glucose is the focus of current research. Here, the research progress and the con-struction of related strains or vectors were reviewedKey words: genetic engineering; lignocellulose; xylose; glucose; gene recombination; ethanol木質(zhì)纖維是地球上數(shù)量最大的一種可再生資源。據(jù)多種產(chǎn)物。人們通過代謝工程的手段構(gòu)建重組菌,使之能估算,如果發(fā)展能源林業(yè)與回收利用廢棄木質(zhì)纖維并舉,夠發(fā)酵葡萄糖、木糖或者阿拉伯糖產(chǎn)生酒精。將分子生物則每年可保障替代I3以上運輸燃料的酒精產(chǎn)量。為此,發(fā)學手段用于開發(fā)能發(fā)酵六碳糖和五碳糖的產(chǎn)乙醇優(yōu)良菌展經(jīng)濟有效而環(huán)境友好的木質(zhì)纖維生物轉(zhuǎn)化乙醇技術(shù),株主要從2方面著手:一是對常規(guī)的產(chǎn)乙醇菌株(如:Sac已成為世界生物能源科技發(fā)展的研究熱點。木質(zhì)纖維主 charomyces cerevisiae、 Zymomonas mobilis)進行工程改造要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素和半纖維素拓寬其底物利用范圍;二是對能天然利用多種底物的微經(jīng)過糖化和發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇而木質(zhì)素的降解物不含可發(fā)生物(如 Escherichia coli, Klebsiella oxytoca、 Erwinia等)進酵糖,只能通過燃燒供熱(發(fā)電)或化學轉(zhuǎn)化為燃料添加劑行工程改造,賦予并提高其產(chǎn)乙醇能力(其他生物制品或工業(yè)原料)加以綜合利用嗎1.1木糖的代謝途徑美國等國家已開始將生物能源研究和開發(fā)的戰(zhàn)略重雖然半纖維素多聚體的降解比較容易,但其降解產(chǎn)物心轉(zhuǎn)移到以木質(zhì)纖維生產(chǎn)乙醇的方向。針對我國國情,發(fā)戊糖(主要是木糖)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇則要比纖維素的降解產(chǎn)展以木質(zhì)纖維生物轉(zhuǎn)化乙醇為重點的生物能源技術(shù),建立物葡萄糖的發(fā)酵困難得多。自然界存在著某些天然利用以能源林業(yè)為依托并綜合利用大量農(nóng)業(yè)廢棄物(如秸稈、木糖的微生物,包括細菌、酵母菌和絲狀真菌,真菌與細皮殼等)林業(yè)殘余物(如鋸木屑、刨花、木材和造紙工業(yè)菌的木糖代謝途徑不盡相同廢料等)、城鄉(xiāng)垃圾和雜草等低成本木質(zhì)纖維資源的原料利用木糖的酵母菌及絲狀真菌的木糖代謝途徑,首先保障模式,可以避免以糧食為原料所帶來的“與農(nóng)爭地和是在依賴 NADPH的木糖還原酶作用下還原木糖為木糖“與人爭糧”的弊端,兼得經(jīng)濟、生態(tài)、環(huán)保、社會多重效益,醇隨后在依賴NAD的木糖醇脫氫酶作用下氧化形成木是全面協(xié)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的必然要求。酮糖,再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化形成磷酸木酮糖由此進入1代謝途徑磷酸戊糖途徑。PPP途徑的中間產(chǎn)物磷酸葡萄糖及磷酸利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)酒精實現(xiàn)商業(yè)化的主要技甘油醛通過酵解途徑形成丙酮酸,丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸術(shù)難題在于開發(fā)合適的菌種。淀粉質(zhì)原料水解液中主要是脫羧酶、乙醇脫氫酶脫羧還原為乙醇:或是在好氧的條件葡萄糖,而木質(zhì)纖維素水解液中除含有葡萄糖等六碳糖外,下通過TCA循環(huán)及呼吸鏈徹底氧化成CO2。釀酒酵母菌還含有木糖、阿拉伯糖等五碳糖。傳統(tǒng)的酒精工業(yè)所采用因缺乏木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶,而不能利用木糖,但可以的菌種酵母和運動發(fā)酵單胞菌都不能發(fā)酵木糖或阿拉伯利用中國煤化工在酸酒酵母菌中木酮糖糖.自然界的一些細菌雖能發(fā)酵五碳糖但是其發(fā)酵產(chǎn)生也是CNMH進入PP途徑經(jīng)酵解形收稿日期:200810-13作者簡介:王敏(191),女,河北景縣人,講師,研究方向為食品發(fā)酵2009No.2·12· Serial No203China BrewingForum and Summary成乙醇的作用下磷酸化形成磷酸木酮糖進入PP途徑,但與PP與真菌(酵母菌及絲狀真菌)的木糖代謝途徑不同細途徑偶聯(lián)的是ED途徑,通過ED途徑產(chǎn)生乙醇間菌的木糖代謝途徑是通過木糖異構(gòu)酶直接轉(zhuǎn)化木糖形成12葡萄糖代謝途徑木酮糖,該酶不需要輔酶的參與,隨后同樣在木酮糖激酶葡萄糖主要通過EMP途徑生成乙醇。a:糖代謝途徑b:2-酮-3-脫氧6磷酸葡萄糖途徑腺苷三磷酸木糖異構(gòu)醇腺苷二磷酸葡萄糖6-磷酸木酮糖葡萄糖酸內(nèi)酯6磷酸木酮糖激酶腺苷三磷酸6磷酸葡萄糖酸腺苷二磷酸5-磷酸木酮糖一5-磷酸核酮糖←-5-磷酸核糖2酮3-脫氧6磷酸葡萄糖酸轉(zhuǎn)酮醇酶甘油醛3磷酸1,3-磷酸甘油酸景天庚酮糖甘油醛3磷酸苷三磷酸轉(zhuǎn)醛醇3磷酸6磷酸果糖2磷酸甘4磷酸赤蘚糖磷酸-果糖磷酸烯醇式丙酮酸2內(nèi)酮酸甘油醛3-磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶乙醛+CO2附圖乙醇代謝選徑Attached figure. Ethanol metabolism pathway2基因工程菌脫氫酶,幾乎沒有酒精產(chǎn)生。陸堅等通過基因工程手段木質(zhì)纖維生物轉(zhuǎn)化乙醇是個動態(tài)發(fā)展、不斷完善的技成功將 Zmobilis乙醇脫氫酶基因adhB克隆病導入大腸桿術(shù)。技術(shù)進步的核心方向或最終目的是要降低生產(chǎn)成本,菌中表達。同時也成功的克隆并表達了丙酮酸脫羧酶pd提高生物乙醇的市場(價格)竟爭力?；静呗允巧锏幕?。外源基因在 Mobil中的克隆和表達系統(tǒng)正逐步完(如工程菌和纖維素酶)和工藝的(如預處理綜合利用和系善。目前,已構(gòu)建了許多載體,但是這些載體在 Z mobilis應統(tǒng)集成)優(yōu)化并舉,特別是生物的改進尚有較大的空間用通常不穩(wěn)定,如何提高外源基因的表達與活性水平是構(gòu)21大腸桿菌建高性能 amabilis工程菌的關(guān)鍵大腸桿菌( Escherichia coli的野生菌株能夠利用非常美國佛羅里達大學的 JINGRAM LO等于20世紀80年廣泛的碳源,其中包括六碳糖(葡萄糖、果糖、甘露糖)和五代就嘗試了以外源基因補充(或改進)受體微生物的發(fā)酵碳糖(木糖、阿拉伯糖)以及糖酸等物質(zhì),即大腸桿菌可以代謝途徑。他們將 Amabilis的C6發(fā)酵基因轉(zhuǎn)入具備C5發(fā)利用木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生的各種糖類。但是野生型大腸酵途徑的 Escherichia coli除了成功使大腸桿菌獲得在富氧桿菌缺少強有力的產(chǎn)醇發(fā)酵酶系統(tǒng);厭氧發(fā)酵時糖代謝的和缺氧條件下發(fā)酵丙酮酸的功能外,這個由 lactose啟動子主要產(chǎn)物是各種有機酸,乙醇含量很低。故大腸桿菌菌種加pd和adh基因串聯(lián)組合的操作元還使丙酮酸的代謝具改造的重點是增強其產(chǎn)醇能力。為了實現(xiàn)這一目標,一般有向中國煤化工并使微生物生長明顯優(yōu)是用基因工程手段將運動發(fā)酵單胞菌的2個基因,pdc(丙于對CNMHGcellulolyticum中也得到酮酸脫羧酶基因)及adh(乙醇脫氫酶基因),克隆到大腸桿較好的表達。相對酵母菌發(fā)酵(以小時計)來說細菌發(fā)菌中,促使丙酮酸定向地轉(zhuǎn)化成乙醇。酵有速度快(以分鐘計)的優(yōu)勢。大腸桿菌能利用幾乎所有的戊糖和己糖但缺乏乙醇22運動發(fā)酵假單胞菌專論與綜述中國釀造2009年第2期總第203期·13·運動發(fā)酵假單胞菌( Zymomonas mobilis)代謝途徑簡菌較初始菌株木糖消耗和乙醇產(chǎn)率分別有很大提高單,通過ED途徑專一代謝葡萄糖、果糖、蔗糖作為碳源和GOVINDASWAMY S等嗎利用木糖發(fā)酵重組菌 SI cere能源。利用葡萄糖和果糖時,能夠得到近似理論產(chǎn)量的乙 viSIte424A,研究了不同培養(yǎng)基上發(fā)酵木糖和葡萄糖的生醇。用酒精酵母菌發(fā)酵時葡萄糖經(jīng)EMP途徑生成乙醇。Z長動力學和乙醇產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體在只含木糖的培養(yǎng)基mobilis酒精發(fā)酵的缺點是碳源利用面窄,僅限于葡萄糖、上的生長速度要慢于含葡萄糖或木糖-葡萄糖混合物的培果糖和蔗糖,而且代謝產(chǎn)物中副產(chǎn)物較多(如乳酸、乙醛、養(yǎng)基。在木糖葡萄糖混合培養(yǎng)基中,葡萄糖被優(yōu)先利用醋酸硫化氫等)。另外缺少對木質(zhì)纖維素水解液中存在的當向木糖培養(yǎng)基中添加葡萄糖時,木糖的利用率會降低,五碳糖(主要為木糖)的代謝能力。因此,運動發(fā)酵單胞菌說明葡萄糖對木糖的利用產(chǎn)生了阻礙的基因工程改造的主要目的就是拓寬其代謝的碳源類近年來,生物技術(shù)在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化乙醇中的應用研型,使其能代謝五碳糖。究,加速其技術(shù)工業(yè)化的進程,已成為該項技術(shù)研究者關(guān)Z mobilis的遺傳改造主要是將產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵酶(丙酮注的一個熱點。而我國的植物纖維資源豐富,農(nóng)業(yè)、森林酸脫羧酶和乙醇脫氫酶)移入其他可以利用淀粉質(zhì)原料的食品發(fā)酵、輕化工業(yè)等都存在有大量可利用的纖維素資菌種中或者將其他微生物中相關(guān)的淀粉質(zhì)原料水解酶基因源叫,早日將其應用于工業(yè)化生產(chǎn)乙醇的過程,是我國能轉(zhuǎn)移到 Amabilis中,從而獲得乙醇產(chǎn)率高的 Amabilis菌株明。源可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。美國國家再生能源實驗室的 ZHANG M等叫在1995年使用穿梭質(zhì)粒pZB5,將取自大腸桿菌的4個基因:木糖異參考文獻:[陳介南,王義強何鋼等木質(zhì)纖維生產(chǎn)燃料乙醇的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)酶基因(xyA),木酮糖激酶基因(xyB),轉(zhuǎn)醛醇酶基因門林業(yè)科學,2007,43(5):99-105(aB)和轉(zhuǎn)酮醇酶基因(AD引入運動發(fā)酵單胞菌細胞中。(2] SEUNGDO K, BRUCE E D. Global potential bioethanol production通過木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的作用,可以有效地將木糖from wasted crops and crop residues []. Biomass Bioencrg, 2004, 26:轉(zhuǎn)化成5-磷酸木酮糖,而在轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的作用下,361-375.5-磷酸木酮糖進一步轉(zhuǎn)化成葡萄糖6-磷酸和甘油醛3-磷因]孫金風,諸葛健,王正樣重組腸道細菌作為產(chǎn)乙醇生物催化劑的研酸。這2種物質(zhì)進入ED代謝途徑后,在運動發(fā)酵單胞菌自究進展[工業(yè)微生物2004,34():44[4]鮑曉明高東,王祖農(nóng)木糖代謝工程菌的研究進展D]生物工程學身的酶作用下生成乙醇報,1998,14(4):355358.23酵母菌]陸堅,韋宇拓,黃等利用葡萄糖、木糖生產(chǎn)燃料酒精的基因木質(zhì)纖維含有半纖維素其糖化不僅產(chǎn)生C6糖①gh工程菌構(gòu)建廣西農(nóng)業(yè)生物科學2005,24(3):1817-190.cose及其異構(gòu)體),而且有C糖(D- xylose和 L-arabinose)。阿 6INGRAM L O, CONWAY T. genetic engineering of ethanol production由于普通酵母菌只能發(fā)酵C6糖,對C5糖缺乏代謝能力,而in Escherichia coli []. Appl Environ Microb, 1987, 53(10) 2420-2425.且易受降解產(chǎn)物的抑制,半纖維素的利用在相當長的時期被⑦ ALTERTHUM F, INGRAMLO. Eficient ethanol production from g忽視,直接影響了木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化乙醇的經(jīng)濟效益。ron microb,198955(8):1943-1948.自然環(huán)境下然微生物不能夠?qū)⒛举|(zhì)纖維糖化液中的C糖高衛(wèi)華,張敏華劉成等能利用五碳糖和六碳糖生產(chǎn)乙醇的基因和C5糖同時快速有效地轉(zhuǎn)化為乙醇,因此開發(fā)對C6糖和工程菌菌株的構(gòu)建D工業(yè)微生物,2004,34(1):5662C糖進行快速、完全、同步發(fā)酵并且抗逆性強的工程菌株劉艷趙海戚天勝運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇研究進展U成為當務之急。酸酒科技,2006(3):9294郭亭等叫以AS2190作為出發(fā)菌株,在其中建立木[10] ZHANG M, EDDY C, DEANDA K, et al. Metabolic engineering of a糖代謝途徑,并對工程菌株GZ4-127進行初步酒精發(fā)酵研pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomoas mobilisE]Science,1995,267(5195):240243究。但對木糖的利用過程中,乙醇的產(chǎn)率很低,遠遠不能滿(1]郭亭梁達奉鮑曉明、工業(yè)酸酒酵母木糖代謝途徑的建立及酒精足要求。發(fā)酵初步研究門甘蔗糖業(yè),2007(3):2629沈煜等四根據(jù)代謝工程原理,利用整合載體 D YMIKP,[2沈熳,王顆,史文龍等釀酒酵母工業(yè)菌株中Ⅺ木糖代謝途徑將來自 TI thermophilus的木糖異構(gòu)酶XD基因(xylA)和的建立門中國生物工程雜志,2005,25():69-73.SI cerevisiae自身的木酮糖激酶XK)基因(xksl)插入釀[3] GOVINDASWAMY S, VANE L M. Kinetics of growth and ethanol酒酵母工業(yè)菌株NAN227的染色體中,在釀酒酵母工業(yè)菌中國煤化工using genetically engineeredhnol,2007,98(3):677685.株中建立了Ⅺ1路徑的木糖代謝途徑,得到工程菌株[4CNMHG精的研究進展門中國釀NAN2114。木糖、葡萄糖共發(fā)酵搖瓶實驗結(jié)果表明,工程2006(8):11-15