第22卷第4期分析測試學(xué)報(bào) Vol.22 No.42003年7月 FENXI CESHI XUEBAO( Journal of Instrumental Analysis)Jul.2003乙醇含量的酶法測定柳暢先,陳勇(中南民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢430074)摘要:利用醇脫氫酶(ADH)催化乙醇與氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD反應(yīng)的原理,通過測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH吸光度的變化率得出其酶促反應(yīng)速度,對(duì)應(yīng)不同的乙醇含量而制得標(biāo)準(zhǔn)曲線,試樣中乙醇含量由測定值查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得;討論了pH值和抑制劑對(duì)測定的影響;方法簡便、快速、準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞:乙醇;酶催化法醇脫氫酶中圖分類號(hào):0657.320623.41文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-4957(2003)04-0096-02乙醇含量的測定方法通常有比重瓶法、氣相色譜法、伏安法等,近年來酶法在分析測定方面得到廣泛應(yīng)用,以酶法測定乙醇含量已有報(bào)道1-31。本研究基于醇脫氫酶催化乙醇反應(yīng):ChoH+NAD+CH CHO+NAH,通過測定還原型煙酰胺腺嘌呤核苷酸NADH吸光度的變化率得出其酶促反應(yīng)速度,對(duì)應(yīng)不同乙醇含量制得標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而可測定試樣中的乙醇含量。由于酶促反應(yīng)的專一性,可避免試樣中眾多共存組分的干擾,減少繁雜的預(yù)處理過程。作者應(yīng)用酶促反應(yīng)速度測定法,不需要底物轉(zhuǎn)變完全,可減少測定時(shí)間,節(jié)省酶的用量,并獲得較高靈敏度。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑UV-9100型分光光度計(jì)(深圳愛克分析儀器有限公司,光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠),phs-3c型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)WH-1型渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,醇脫氫酶(ADH),0.05mol/L氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD),0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷Tris),0.2mol/L乙二胺四乙酸二鈉EDTA1.2實(shí)驗(yàn)方法于石英比色皿中加入3mL0.05mol/ Tris--HCl緩沖液,40μL1.7mol/L乙醇標(biāo)準(zhǔn)液,以及40L0.05mol/LNAD溶液后混勻,再加入10μLADH溶液,快速混勻后立即在所選定的波長處測定吸光度變化值△A(每隔15s測定一次吸光度值,共10次)計(jì)算酶促反應(yīng)速度v:v=△A(△tEb)式中,v為酶促反應(yīng)速度(mol/min);△A為吸光度變化值;V為反應(yīng)液體積(mL);△t為時(shí)間變化值(min);為摩爾吸收系數(shù)(L/mmol cm);b為比色皿寬度(cm)。根據(jù)米氏方程由酶促反應(yīng)速度可求出乙醇濃度:1/v=K()+1式中,K為米氏常量(mol/L)v為最大酶促反應(yīng)速度(umol/min)c為乙醇濃度(mol/L)2結(jié)果與討論2.1NADH吸收光譜本法是通過NADH吸光度的變化率測定反應(yīng)速度,因此需進(jìn)行NADH吸收波長實(shí)驗(yàn),在無其它雜質(zhì)吸收峰干擾的情況下,可選擇最大吸收波長,本實(shí)驗(yàn)選擇340mm作為測定波長。2.2pH值的影響反應(yīng)溶液的pH值不但影響酶的穩(wěn)定性,還影響酶活性部位中重要基團(tuán)的解離狀態(tài),酶-底物復(fù)合物以及底物的解離狀態(tài),從而影響酶促反應(yīng)速度。按實(shí)驗(yàn)方法在pH6.0~12.0范圍內(nèi)研究了pH值對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。由圖1可知,最佳pH值約為8.6基金項(xiàng)目:國家民族員會(huì)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目第4期柳暢先等:乙醇含量的酶法測定972.3共存組分的影響試驗(yàn)了其它醇類如甲醇、異丙醇、正丁醇、乙二醇、丙三醇與NAD的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)正丁醇在ADH的作用下與NAD也發(fā)生反應(yīng),但反應(yīng)速度與乙醇相比要小得多。另外,由于本研究所用的20酶法是酶促反應(yīng)速度的測定,如果試樣中某些共存組分為激活劑10或抑制劑,它們將可能改變反應(yīng)速度而干擾測定。而金屬離子0易與酶活性部位中的基團(tuán)作用,因此試驗(yàn)了常見金屬離子Mg+、5689101112 pHCa2+、Sb3+、Mn2+、Cr+、Pb2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、C+、Hg2+對(duì)測定的影響,未見有激活作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Zn2+、C+、圖1pH值的影響Hg2+對(duì)酶促反應(yīng)速度有抑制作用。由圖2可見,隨著抑制劑加入 Fig.1 Effect of pH on speed of the過加入EDTA與抑制劑絡(luò)合可部分消除其影響。對(duì)2.5mmol/ enzymatic reaction量增多,對(duì)酶活性的抑制作用逐漸加強(qiáng),反應(yīng)速度逐漸下降。通的乙醇進(jìn)行干擾試驗(yàn),存在5mmol/ EDTA,相對(duì)誤差在±5%80之內(nèi)時(shí),干擾組分的允許量(μmol/L)為Zn2+1700、Cd+30、60Hg2+0.3402.4標(biāo)準(zhǔn)曲線20按實(shí)驗(yàn)方法測出系列乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的酶促反應(yīng)速度,由于反應(yīng)速度只是在底物濃度很低時(shí),才與之成正比,當(dāng)?shù)孜餄舛仍龈?20406080(Cd'*Xumol-Il)時(shí),v-c(C2HOH)線逐漸彎曲,而根據(jù)米氏方程,1/v-1/c(Znyumol-L)( nmol-L)(C2HOH)為直線關(guān)系,因此用雙倒數(shù)作圖法所繪1/v-1/c圖2抑制劑的影響(CHOH)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍較寬。c(CHo)在g Effect of inhibitor on speed of0.5~20mmol/L范圍內(nèi)與v呈直線關(guān)系。其回歸方程為: the enzymatic reaction/v=0.2113/c+0.0159,r=0.9971.+2.c+;3.n2+2.5血清乙醇含量的測定及回收試驗(yàn)按實(shí)驗(yàn)方法測定了小牛血清中的乙醇含量并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表1表1試樣測定及加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5) Table 1 Determination results of ethanol in samples and recovery for added standard(=5) Original RSD Sample Added Total found Recovery/()/%/(mg) /(mg L")45.353.151.2597.810255.501.051.25104.169566.193.576.84139.495參考文獻(xiàn):[ ATWATER JE AKSE DEHART,tal. Enzymatic determination of ethanol using' electrocatalyzed lu minol chemiluminescence[J]. Anal Lett, 1997, 30(8) 1445-1453. [2] CASTANON M JL, ORDIERES A J M, BLANCO PT. Amperometric detection of ethanol with poly-(o-phenylenediamine)- modified enzyme electrodes[J]. Biosens Bioelectron, 1997, 12(6): 511-520. [3] PANDEY PC, UPADHYAY S, UPADHYAY B C, et al. Ethanol biosensors and electrochemic oxidation of NADH[J]. Anal Biochem,1998,260(2):195-203 Enzymatic Determination of Ethanol LIU Chang-xian, CHEN Yong (College of Chemistry and Life Science, South-central University for Nationalities, Wuhan 430074, China) Abstract: An enzymatic method was applied to determine ethanol based on the reaction of ethanol and nicoti-第22卷第4期分析測試學(xué)報(bào) Vol.22No.42003年7月 FENXI CESHI XUEBAO( of Instrumental Analysis)Jul.2003用混合粘合劑修飾的碳糊電極測定諾氟沙星朱明芳1,宋粉云1,毋福海2,曾勇勝3,常青,黃慶華,廖月鏡(1.廣東藥學(xué)院藥學(xué)系,廣東廣州5102242.廣東藥學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,廣東廣州5102243.廣東省陽西縣衛(wèi)生防疫站檢驗(yàn)科,廣東陽西529500)摘要:在pH10.50的磷酸鹽緩沖溶液中,當(dāng)含有0.mmol/的NCl,8mg/L的S(十二烷基磺酸鈉)時(shí),諾氟沙星在由69.1%(w)的石墨粉、24.5%()的液體石蠟和6.4%(w)的甘油組成的混合粘合劑碳糊電極上產(chǎn)生一靈敏的陰極溶出還原峰,峰電位為1.61V;峰電流與諾氟沙星濃度在8.0×10--4.0×10-7mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為r=0.9949,檢出限為3.0×10-mol/L;該法用于測定諾氟沙星膠囊含量,結(jié)果令人滿意。關(guān)鍵詞:諾氟沙星;碳糊電極;伏安法中圖分類號(hào):0657.15R978.19文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-495200304-0098-03諾氟沙星norfloxacin,NF)又名氟哌酸,屬于第三代喹諾酮類抗菌藥物。由于本品具有抗菌譜廣、副作用小以及與其它藥物交叉耐藥性較少等特點(diǎn),廣泛用于臨床。其測定方法有非水滴定法紫外分光光度法21、熒光分光光度法3、極譜法4色譜法5-7等。用碳糊電極測定諾氟沙星未見報(bào)道。作者研究諾氟沙星在混合粘合劑碳糊電極上的伏安行為。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑JP3-1型示波極譜儀山東電訊七廠),三電極系統(tǒng),自制碳糊電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為對(duì)電極;821型袖珍數(shù)字式pH酸度計(jì)中山大學(xué)電子廠諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0mmol/L):準(zhǔn)確稱取0.069g諾氟沙星原料藥(純度為99.3%由廣州市僑光制藥廠提供),用2mL0.1mol/LHCl溶解,稀釋至100mL,貯于棕色容量瓶中保存;SL十二烷基磺酸鈉溶液(1.0g/L):稱取0.10gSL(分析純),用水溶解并稀釋至100mL;石墨粉光譜純,上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠)液體石蠟分析純廣東汕頭新寧化工廠);甘油(分析純,廣州化學(xué)試劑廠)其它試劑均為分析純,溶液按常規(guī)方法配制,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。1.2液體石蠟-甘油混合粘合劑碳糊電極的制備1.30g石墨粉、0.46g液體石蠟、0.12g甘油混合攪拌均勻后,填入內(nèi)徑為4.0mm,長為50mm的玻管中,用玻棒壓緊,插入銀絲作導(dǎo)線,在光滑的紙上拋光,備用。1.3實(shí)驗(yàn)方法取1.8mLpH10.50的磷酸鹽緩沖溶液、0.4mL0.02mol/LCl和0.4mL0.2g/LSLS溶液混合,加入適量的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合均勻,稀釋至10mL,用液體石蠟-甘油混合粘合劑碳糊電極作工作電極,在-0.70V處靜止富集9s,記錄陰極溶出伏安曲線,測量-1.61V處的導(dǎo)數(shù)波高。其中掃描范圍為-0.70~-1.99V,掃速400mV/s收稿日期:2002-09-07;修回日期:2003-05-14作者簡介:朱明芳(1970-),女,湖南邵陽人,講師,碩士 namide adenine dinucleotide in oxidized form(NAD) catalyzed by alcohol dehydrogenase(ADH). The change rate of the absorbance of nicotinamide adenine dinucleotide in reduced form (NADH) was detemmined to obtain the velocity of the enzymatic reaction and the calibration curve of ethanol was drawn. The ethanol in samples was determined by the calibration curve. The effect of the pH and the inhibitor was discussed. The method is simple, rapid and accurate.