2002年第4期.糧食與油脂39文章編號(hào): 1008-9578(2002)04- -039--03脂質(zhì)分析進(jìn)展Development in Lipids Analysis喬國(guó)平王興國(guó)孫冀平胡學(xué)煙(江南大學(xué)食品學(xué)院， 無(wú)錫214036)摘要概述近年來(lái)脂質(zhì)分析方法最新進(jìn)展，簡(jiǎn)要介紹微波輔助提取法、超臨界CO,提取法在脂質(zhì)舍量測(cè)定方面的應(yīng)用及原位脂肪酸甲酯合咸法在簡(jiǎn)化脂質(zhì)分析中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞脂質(zhì)分析徵波法超臨界CO, 法原位脂肪酸甲酯合威法中圖分類號(hào): TQ646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A近年來(lái),因脂肪酸營(yíng)養(yǎng)特性和健康方面的影響,對(duì)脂肪可以對(duì)樣品一溶劑混合物進(jìn)行選擇性加熱,使得脂質(zhì)在提取酸進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析就變得越來(lái)越重要。一般講，脂肪總過(guò)程中受到不利條件的影響要比傳統(tǒng)的加熱方式要小。另量要用索氏(Soxhlet)抽提器測(cè)量，而脂肪酸主要是通過(guò)氣外,微波技術(shù)也可應(yīng)用于脂肪酸甲南的合成(4)和脂肪酸原位相色譜法(GC)來(lái)測(cè)定。因脂肪酸的沸點(diǎn)較高，進(jìn)行色譜分衍生化[5),加速反應(yīng)速度,提高反應(yīng)效率。析時(shí)，要將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯、異丙酯或丁南,而其中到現(xiàn)在為止,對(duì)微波輔助脂質(zhì)提取雖然只有少量的研究又以脂肪酸甲嘴的沸點(diǎn)較低,在色譜圖中所產(chǎn)生的峰形也較報(bào)告,但是對(duì)微波技術(shù)在分離有機(jī)化合物方面的廣泛深入的突出,所以在分析生物體組織或食品中的脂肪含量和脂肪酸應(yīng)用和其明顯的效果正日益受到人們的關(guān)注,與之相關(guān)的微組成時(shí)經(jīng)常進(jìn)行的是脂肪酸的甲酯化。在進(jìn)行脂肪酸甲酯波脂質(zhì)提取設(shè)備也會(huì)不斷在實(shí)踐中得到應(yīng)用。化時(shí),為了避免干擾,常常要將脂質(zhì)用有機(jī)溶劑從樣品中提1.2超臨界二氧化碳流體提取取出來(lái),然后在催化劑作用下使脂質(zhì)衍生化而生成胎肪酸甲利用有機(jī)溶劑提取法對(duì)各種含脂肪樣品進(jìn)行脂肪含量酯,再用GC法測(cè)定脂肪酸組成。整個(gè)過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)，且費(fèi)用測(cè)定時(shí)，因?yàn)? 些脂寤性色素、蠟質(zhì)和膠質(zhì)也溶于非極性溶很商。此外,索氏脂肪測(cè)定法只能測(cè)定樣品中的粗脂肪含劑而被同時(shí)提取出來(lái)，因此傳統(tǒng)的索氏抽提法只能測(cè)定粗脂量,不能對(duì)脂肪含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。因此,許多研究工作者肪的含量,而不能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中脂肪的含量。而且,使-直在尋求一種快捷、簡(jiǎn)單的方法來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法。近年用傳統(tǒng)的方法測(cè)定脂肪時(shí)，還要消耗大量揮發(fā)性溶劑，會(huì)造來(lái),出現(xiàn)了與這種需求相適應(yīng)的幾種新的提取方法和脂肪酸成環(huán)境污染并對(duì)操作人員的健康構(gòu)成威脅,整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間很測(cè)定方法，如徼波輔助提取法和超臨界流體提取(SFE)法，長(zhǎng),消耗能量高。近來(lái)，有研究工作者已開始嘗試使用越臨以及脂肪酸原位(in situ)脂肪酸甲酯合成技術(shù)等。界流體提取技術(shù)進(jìn)行脂質(zhì)的定分析，可以避免使用有毒的1提取新技術(shù)有機(jī)幫劑，減少實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間,提高效率。而在此之前,超臨1.1微波輔助脂質(zhì)提取界流體技術(shù)只用于大批量的脂質(zhì)提取。在進(jìn)行超臨界流體近來(lái)已有關(guān)于微波技術(shù)用于脂質(zhì)提取的報(bào)道。利用微萃取過(guò)程中使用最多的是超臨界CO2。波技術(shù)可以發(fā)展-種快捷、安全、代價(jià)低的方法來(lái)進(jìn)行各種有研究工作者已經(jīng)將超臨界流體提取與傳統(tǒng)的方法進(jìn)行生物質(zhì)的脂肪含量測(cè)定，而且,所處理的樣品還可以不受水比較。Frod(6)等對(duì)幾種油料種子、 牛肉和幾種焙烤食品中的分的干擾(u,這使樣品的預(yù)處理變得更簡(jiǎn)單,也避免了脂質(zhì)脂肪含量用超臨界二氧化碳進(jìn)行測(cè)定,每份樣品重1克,操作在進(jìn)行高溫干燥時(shí)氧化和變質(zhì)。壓力9,000 psi,溫度100C,流速2L/分鐘,在穩(wěn)定后萃取25最初關(guān)于利用微波技術(shù)對(duì)脂質(zhì)提取進(jìn)行可行性研究出現(xiàn)分鐘。然后再將所得到的脂肪進(jìn)行甲酯化,用GC法測(cè)定脂在二十世紀(jì)八+年代,Ganzier2)等用微波輔助對(duì)油料種籽、肪酸含量。最后對(duì)超臨界流體直接所得脂肪質(zhì)量、GC法換算食品飼料和土壤中的脂肪含量進(jìn)行測(cè)定，在操作中,他們將的脂肪含量以及傳統(tǒng)的方法所得結(jié)果進(jìn)行比較，得到了滿意一定量的溶劑和樣品混合后,用微波對(duì)樣品進(jìn)行30秒輻射處的結(jié)論。Sot(]等人對(duì)幾種油料種籽在1000psi壓力理(在處理過(guò)程中避免溶劑拂騰) ,冷卻后再進(jìn)行處理，重復(fù)幾80C下用超臨界流體處理3.0~3.5克樣品,將所得脂肪含量次。然后進(jìn)行離心分離,上清液揮千溶劑，并將所得脂肪用氣與索氏抽提法測(cè)定的脂肪含量進(jìn)行比較,得到了滿意的結(jié)果。相色譜柱檢測(cè)脂肪酸組成，證明比傳統(tǒng)方法的效率要高很多。Dionisl[8]等對(duì)奶粉、牛奶巧克力等含脂食品中脂質(zhì)利用超臨近來(lái),隨此項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了-些使用少量溶劑進(jìn)行界CO2進(jìn)行萃取,回收率達(dá)到98.4%,并對(duì)所得脂肪進(jìn)行脂微波輔助提取的設(shè)備。Lerayl3等 用此設(shè)備對(duì)生物組織中的肪酸組成分析，與傳統(tǒng)的方法相比沒(méi)有明顯差別。對(duì)于超臨各種脂質(zhì)進(jìn)行了定性和定量分析,并與傳統(tǒng)的方法進(jìn)行比較，界流體進(jìn)行脂質(zhì)萃取的研究還有相當(dāng)多的報(bào)道(9.0],都對(duì)這種證明用此方法不但使用的溶劑量很少,所用時(shí)間短,而且所得新技術(shù)可行性進(jìn)行大量k研究工作。脂質(zhì)與傳統(tǒng)的方法所得相比并沒(méi)有區(qū)別。超臨界流體進(jìn)行脂質(zhì)萃取時(shí)，為了得到滿意的結(jié)果,應(yīng)雖然用徼波處理樣品時(shí)也會(huì)引起脂質(zhì)的氧化和脂肪酸中國(guó)煤化工就是溫度和壓力,因?yàn)楹康淖兓?但在通常條件下這種變化是很小的,而且與傳它YH另外,只使用超臨界.統(tǒng)方法所引起的同樣的變化要小得多。這主要是因?yàn)槲⒉╟d.C.N M H G份的提取有很好的效收稿日期: 2002-02-084(糧食與油脂2002年第4期果,但對(duì)于非極性脂質(zhì)萃取效果很差。因此對(duì)于含有-定量果是對(duì)已提取出來(lái)的脂肪進(jìn)行甲酯化,則不必考慮水的影響。非極性朋質(zhì)的樣品(如牛奶)就不大適用。為了提高非極性但采用原位法直接對(duì)樣品進(jìn)行脂質(zhì)的酯交換，樣品是不可能完脂質(zhì)的回收率,可以在超臨界流體中添加少量的甲醇、乙醇，全脫水的。在水份達(dá)到-定量時(shí)，甘三酯很容易從單一相中分甚至是水作為挾帶劑。Monanil)等利用兩步萃取法(超離出來(lái)，從而減緩反應(yīng)，甚至中止反應(yīng)繼續(xù)下去。Austin[14)臨界CO2.超臨界CO2/乙醇混合流體)對(duì)大豆進(jìn)行脂肪和等人對(duì)大豆粕等多種含油樣品進(jìn)行分析時(shí)，采用已烷作溶磷脂的分別提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)極性較強(qiáng)的磷脂選撣性地溶于超劑，堿性催化劑處理I0mg樣品,80"C下加熱10分鐘完成臨界CO2/乙醇混合流體中。此外,樣品的粉碎程度和含水脂質(zhì)的衍生化。樣品中水份達(dá)到10%時(shí),甲酯化幾乎已經(jīng)量也應(yīng)考慮在內(nèi)。不能發(fā)生，而在8%時(shí)影響不大。Franz1)用 酸性催化劑，超臨界流體萃取技術(shù)可以在很多方面取代傳統(tǒng)的脂肪含甲苯為溶劑對(duì)含脂肪10~50mg的食品樣品進(jìn)行原位酯交量測(cè)定方法,但還存在者操作設(shè)備昂貴對(duì)非脂質(zhì)成份(例如換反應(yīng)，加入100 mg水對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。因此，在進(jìn)水)的萃取,以及在某些情況下對(duì)脂肪提取不完全等缺點(diǎn),因此行酯交換反應(yīng)時(shí)，必須考慮到對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響的各種因.對(duì)于操作時(shí)的條件還應(yīng)該不斷優(yōu)化，以能得到滿意的結(jié)果。素,而且溶劑的選擇與催化劑的種類也有-定的關(guān)系。2原位(in situ)脂肪酸甲酯合成2.2 催化劑選擇對(duì)于各種含油物質(zhì)的脂肪酸組成分析,-般的方法是進(jìn)行原位脂質(zhì)衍生化所用的催化劑,與傳統(tǒng)甲酯化反應(yīng)先用有機(jī)溶劑將脂肪萃取出來(lái),然后在催化劑作用下進(jìn)行使用的相類似,包括重氮甲烷酸性催化劑(HCIHSO,脂肪酸的衍生化得到脂肪酸甲酯,最后用GC法測(cè)定脂肪BF;)和堿性催化劑NaOCH,NeOH和KOH)等。重氮甲酸組成和含量。這種傳統(tǒng)的方法需要大量的溶劑，操作繁烷是一種高效、快速的酯交換催化劑,但因操作條件苛刻、使瑣,所用時(shí)間很長(zhǎng)，效率不高。因此,研究工作者一直在尋用壽命短而不被廣泛采用。在實(shí)際操作中常使用的是酸或求一種簡(jiǎn)便、易行的方法進(jìn)行脂質(zhì)的分析,其中最有成效的堿性催化劑。就是脂肪酸甲南的原位(in siu)合成法。“原位” 合成法，2.2.1堿性催化劑是0uen[1]等人于1976 年提出來(lái)的，即不進(jìn)行脂質(zhì)的提堿基催化反應(yīng)速度快，條件襤和,在室溫下即可發(fā)生反取過(guò)程，而是直接對(duì)樣品用少量的有機(jī)溶劑和催化劑處理應(yīng),對(duì)-些酸不穩(wěn)定脂肪酸(如含有環(huán)丙烯、環(huán)氧基等基團(tuán)，進(jìn)行酯交換,所以又稱為一步萃取- 酯交換法。對(duì)祥晶中以及含共軛不飽和鍵結(jié)構(gòu))尤其適用。但堿性催化劑也有其脂質(zhì)的提取、酯交換同時(shí)進(jìn)行,大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間,減少缺點(diǎn):游高脂肪酸不會(huì)或很少量參加酗化反應(yīng);酯化時(shí)會(huì)發(fā)了有機(jī)溶劑的用量,也因?yàn)椴僮鬟^(guò)程少而減少了實(shí)驗(yàn)誤差。生皂化反應(yīng)等。原位法與一般的脂質(zhì)分析過(guò)程需要3~s克相比，使用的樣堿基催化反應(yīng)使用的有機(jī)溶劑通常為正已烷、石油醚和品量也大大減少，只需要幾十毫克[13]。因此利用原位法進(jìn)二氧雜環(huán)已烷。而使用最多的堿性催化劑為甲醇鈉的甲醇行脂肪酸和脂質(zhì)分析,不但可以分析各種含脂物質(zhì),也可對(duì)溶液，其制法是將金屬鈉投入無(wú)水甲醇中即可得到。此試劑在TLC法分離脂質(zhì)過(guò)程中從展開板上刮下的硅膠中所含可以存放幾個(gè)月。Austin4 等使用甲醇鈉和己烷對(duì)谷物和脂質(zhì)進(jìn)行分析。乳制品中脂質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果與AOAC官方方法相符合。.對(duì)于脂質(zhì)的衍生化，包括脂肪酸的甲酯化和甘三酯的酯Dennis[10]等也使用類似的溶劑對(duì)嬰兒奶粉中的脂質(zhì)進(jìn)行原交換兩個(gè)過(guò)程:位脂肪酸甲酯化,同樣得到滿意的結(jié)果。除了NaOCH,外,還有其它-些有機(jī)類堿性催化劑,如R'-C0-0H+ CH,-0H回p'-CO-0CH。+ HOH四甲基胍鹽(TMG)和氫氧化四甲胺就是比較常用的試劑。R'- co-OR" +CH-OH"威0C*R'-CO-0CH.+R" OH此類有機(jī)堿催化劑不但可以進(jìn)行甘三南的雕交換甲酯化反應(yīng),也可以同游離脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，彌補(bǔ)了NaOCH,不足。脂肪酸只能在酸性催化劑和重氨甲烷作用下進(jìn)行酯化Schuchard(1]等人使用TMG對(duì)游離脂肪酸含f達(dá)6.7%的反應(yīng)，而甘三酯則可在酸性、堿性和重氮甲烷作用下進(jìn)行酯脫膠油進(jìn)行甲酯化,其甲雕化程度可以達(dá)到99%。馬亭[18)交換。對(duì)于天然存在的生物物質(zhì)中的脂質(zhì),脂肪酸-般以甘等人用氫氧化四甲胺1甲醇作為繼化劑和反應(yīng)試劑分析魚三酯或磷脂的形式存在，因此對(duì)于脂肪酸甲甯的合成主要指油中的脂肪酸組成,并使游高脂肪釀轉(zhuǎn)化為氫氧化四甲胺的的是酯交換過(guò)程。脂肪酸鹽,后者在氣相色譜的進(jìn)樣室內(nèi)受熱裂解而生成相應(yīng)在進(jìn)行“原位”脂肪酸甲酯合成時(shí)需要注意兩點(diǎn):脂質(zhì)的脂肪酸甲酯,經(jīng)處理后的樣品直接用于GC/MS和GC分的痦解性(應(yīng)該溶解迅速、反應(yīng)完全)和防止水和其它化合物析,得到滿意結(jié)果。的干擾。因此， 必須根據(jù)樣品的性質(zhì)決定使用何種落劑,是2.2.2酸性催化劑否要進(jìn)行干燥，以及選擇何種催化劑等。因?yàn)樗嵝源呋瘎┛梢詫⒆⑸渲舅岷徒Y(jié)合脂肪酸同時(shí)2.1溶劑選擇進(jìn)行催化而得到廣泛應(yīng)用，但是與堿性催化劑相比，反應(yīng)時(shí)進(jìn)行原位脂肪酸甲酯的合成,需要選用合適的溶劑，此溶需要加熱(50~100C),且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)(1~2小時(shí))。另外, .劑對(duì)脂質(zhì)(特別是不易溶于甲氧基催化劑中的非極性脂質(zhì))有中國(guó)煤化工圖中月桂酸甲酯后會(huì)很好的溶解性，使甲醇、脂質(zhì)和其它試劑形成完全互溶的狀出現(xiàn)YHCNMHG; NMR確定此蜂為r-態(tài)。如果樣品中存在-定量的水份,必須考慮水的影響。如2002年第4期糧食與油脂41HOCH2 ,0.H'MeOH,CH;HzCγ-戊酮酸甲酯峰的出現(xiàn)會(huì)使測(cè)定值偏高，但在高脂肪、lyical Supereitial Fluid Extraction [U]. J. AOCS, 1993, 70低糖分樣品中影響較小。(4): 437-439.酸性催化反應(yīng)使用的溶劑有已烷四氫呋喃、苯甲苯和[8] F. Dionisl el. Supercritical CO, Extracion for Total Fat Ana-氟仿等(2),其中效果最好的是苯,但因?yàn)楸接卸?所以一般傾，lysis of Food Products [印J. Food Sci. 999 64(4); 612--615.向于使用甲苯。常用的酸性償化劑為HCI.H2SO.,BF, 的甲[9] Peter et. Comparison of Supercritical Carbon Dioxide and醇溶液。由于酸性倦化反應(yīng)使用的溶劑、催化劑種類、反應(yīng)條Soxhlet Extraction of Lipids from a Browm Scaweed, Sar-件(溫度、加熱時(shí)間)等各不相同,得到的結(jié)果也不盡相同。gassaon hemipyllum (Turn.) C. Ag J. Agr. Food Chem.Fran{[5]用HC1- CH2OH 作催化劑,以甲苯取代苯作溶劑，1998, 46: 4228- -4232.分析食品中所含脂質(zhì)時(shí),所得結(jié)果與傳統(tǒng)的酸解- -乙醚萃取[10] s. P. J. Brooks et. Measuring Total Lipid Conent in Rat方法相比偏高,但比氯仿-甲醇提取法所得結(jié)果要低。KeCarcasses: A Comparison of CommonlyEmployed Extract-vinf[1]等用H:SO.- -CH2OH 對(duì)葵花籽進(jìn)行原位甲南化,在甲ion Methods []. J. Agr. Food Chem. 1998, 46. 4214- -4217.醇佛點(diǎn)溫度下反應(yīng)4小時(shí)，所得結(jié)果要比己烷提取法為高。(11] Luigi Moitanari et. Selecive Extraction of Phospholipid使用原位法進(jìn)行脂質(zhì)的酯交換,只要選擇合適的催化Mixtures by Ssupereritical Carben Dioxide and Cosolvents劑，反應(yīng)條件恰當(dāng)(含水量、溫度、樣品量、使用的非極性溶[小. J. Food Sci. 1996, 61(6); 1230-1233.劑),理論上得到的定性與定量結(jié)果與傳統(tǒng)的方法相比不會(huì)(12] Outen t. Diret Methylation of Long Chain Fatty Acids in有明顯的差別。而且由于原位合成脂肪酸甲酯操作過(guò)程簡(jiǎn)Feeds, Digesta and Fecs Without Prior Extration ([], J.單，在反應(yīng)過(guò)程中也沒(méi)有加入不利的實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)誤差就Sci. Food Agr. 1976, 27: 419-425.要小得多,所得結(jié)果應(yīng)該比傳統(tǒng)的方法更準(zhǔn)確。實(shí)際上由于[13) M. Sonichsen, B. w. Mulr. A Rapid and Quantitarive祥品中往往含有一定的水分,或是有些脂質(zhì)與樣品結(jié)合的Method for Total Fatty Acid Analysis of Fungi and Other比較牢固而不能完全反應(yīng),為了得到準(zhǔn)確、可信的結(jié)果,需要Biological Samples [0 Lipids. 199, 34(12): 1347-1349.對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。但總的來(lái)說(shuō),脂質(zhì)的原位合成法對(duì)大多[4] Austin R Long, Rapid Direcl Extraction Derivatizaton Mc數(shù)樣品來(lái)說(shuō)都是可行的。thod for the Detcrmination of Acylgycerol Lipids in Selected參考文獻(xiàn)Sarmple Matrices []. J. Food Sai. 1988, 53(3): 940- 942.[1] J. R. Jocelyn Pare et. Use of the Microwave Assisted Pro-[15] Franz Ulberh, Monika Henninger. One Step Extraction/cess in Extration of Fal from Meat, Dairy, and Egg Pro-Methylation Method for Determining the Fatty Acid Compo-ducts under Atmospherie Pressure [J]. J. AOAC, 1997, 80sition of Procesed Foods [u]. J. AoCS. 1992, 69(2): 174 -177.(4): 928- -933.[16] Dennis et. Delerminationof Lipids in Infant Formula Po-[2] Katalin Ganzler et. Microwave Extraction. 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