ETTERS IN BIOTECHNOLOCY Vol.25 No.1 Jan., 201465doi: 10.3969/jissn. 10090002.2014.01.016研究報告重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的聚乙二醇化修飾梁凌宇,雷清,高雪峰,楊軍,應(yīng)蓮芳,蔣琳蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司,甘肅蘭州730046[摘要] 目的:研究重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)突變體的聚乙二醇(PEG)化修飾,對rhCNTF的PEG化產(chǎn)物進(jìn)行初步分離純化及相關(guān)生物活性檢測。方法:采用分子生物學(xué)技術(shù)經(jīng)點突變得到rhCNTF的突變體CNo,通過實驗設(shè)計研究CNo的最佳PEG化條件;采用分子篩層析方式對偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化,最后用ELISA和小鼠體重增長抑制法檢測PEG化后的CNo蛋白的生物活性。結(jié)果:能運用mPEG-MAL對CNu進(jìn)行定點修飾, PEG化后用Superdex200能夠分離CNo;PEG化后的CNo每2 d腹腔注射1次,對小鼠體重的增長抑制率可達(dá)50%,與rhCNTF每天注射2次的體重增長抑制作用相當(dāng)。結(jié)論:CNo蛋白在PEG化修飾后,其減重效應(yīng)持續(xù)時間明顯延長。[關(guān)鍵詞]人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子;聚乙二醇化修 飾;純化;體重增長抑制[中圖分類號] Q78; Q502[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1009-0002( 2014)01-0065-03PEGylation of Recombinant Human Ciliary Neurotrophic FactorLIANG Ling-Yu, LEI Qing, GAO Xue-Feng, YANG Jun, YING Lian-Fang, JIANG Lin*Lanzhou Institute of Biological Products Co. Ltd, Lanzhou 730046, China*Corresponding author, E-mail: jianglin620@ sohu.com[Abstract] Objective: To study the PEGylation of recombinant human ciliary neurotrophic factor( rhCNTF)，estab-lish the preliminary separation and purification of the polyethylene glycol- modified rhCNTF, and then to detect thebiological activity of PEGylation rhCNTF. Methods: Using molecular biology techniques to obtain the mutants CNoof rhCNTF by point mutation, then to study the conditions of PEG conjugation by design of experiment. The prod-uct of PEGylation rhCNTF were purified by molecular sieve chromatography, finally the biological activity were de-tected by ELISA and the method of weight loss in normal mouse. Results: CNo can be successfully fixed- pointmodified by mPEG- MAL, the weight loss in mice experiments showed that the weight inerease inhibitory rate ofPEGylation CNo were u to 50% when received an intraperitoneal injection every other day, it was equivalent toinhibitory efct of rhCNTF which injected twice a day. Conclusion: Afer PEG modification, the biological effectof rhCNTF was significantly prolonged.[Key words] recrecombinant human ciliary neurotrophic factor; PEGylation; weight increase inhibition; purification聚乙二醇(PEG)修飾是20世紀(jì)70年代后期逐因工程重組產(chǎn)品。藥效學(xué)實驗證明, rhCNTF皮下注漸發(fā)展起來的一-項熱門]技術(shù)",目前已用于多種蛋白射(sc)時對大鼠高營養(yǎng)性肥胖和糖尿病合并肥胖模質(zhì)及多肽類藥物的修飾。蛋白質(zhì)藥物經(jīng)PEG修飾型均有明顯的減肥作用,臨床上擬用于治療肥胖后,最顯著的優(yōu)點就是延長了體內(nèi)半衰期,從而可降癥。但是,rhCNTF的體內(nèi)半衰期較短,臨床應(yīng)用時低給藥頻率,以減輕藥物的毒副作用”;同時,由于須每天注射,長期用藥會增加患者的痛苦?；诖?，PEG本身不具備免疫原性,PEG化后,PEG有可能遮我們嘗試采用PEG對巰基修飾的方法來修飾蓋蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇,從而可降低免疫原性rhCNTF,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)4,用定點突變法在蛋白質(zhì)中和抗原性”。因此，蛋白類藥物在PEG修飾后可增引人半胱氨酸,以mPEG-MAL作為聚乙二醇化試強(qiáng)其在臨床上的治療指數(shù),擴(kuò)大臨床使用范圍。本劑,通過把蛋白質(zhì)上的巰基加成到mPEG-MAL的雙研究室研制的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(recombi-鍵上而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定點修飾。此法已在許多蛋nant human ciliary neurotrophic factor , rhCNTF)是白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中取得了良好的效果,其關(guān)一種在CNTF天然序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過改造得到的基鍵在于選擇合適的修飾位點,以避開蛋白質(zhì)的活性位點。本研究迷氣嚴(yán)中國煤化工J rhCNTF突作者簡介:梁凌宇(1978- ), 男,助理研究員收稿日期:2013-05-02變體CNo,并采THCNMH 流基進(jìn)行定通信作者:蔣琳, ( E-mail)jiangin620@sohu.com量定點修飾,對5U10江力網(wǎng)純化后進(jìn)行56LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.25 No.1 Jan, 2014相關(guān)生物活性檢測,以得到符合預(yù)期效用的rthCNTF1.5 CN:o與mPEG-MAL的結(jié)合及結(jié)合蛋白的純化長效化蛋白。在8C條件下將CNo蛋白透析至PB緩沖液(50mmol/L, pH6.8)中進(jìn)行結(jié)合實驗,選擇CNi的初始濃1材料與方法度為1 mg/mL, 物料比為1:1,反應(yīng)24 h后采用10kD超濾膜對反應(yīng)混合液濃縮至1/4,取2 mL濃縮液上1.1 材料樣Superdex 200( 16/60)柱,280 nm波長進(jìn)行監(jiān)測,昆明鼠由本公司實驗動物室提供;大腸桿菌收集第一峰,分別用HPLC和SDS-PAGE檢測PEGBL21(DE3)、含rhCNTF基因(558 bp) 的重組質(zhì)?；疌Nw結(jié)合蛋白的純度。pET/rhCNTF由本室保存;Taq酶.T, DNA連接酶及1.6結(jié)合蛋白的活性檢測限制性內(nèi)切酶Nde I、Aur II均購自TaKaRa公司;胰1.6.1 ELISA活性 采用雙抗體夾心法,抗體為- -蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xiod公司;PCR引物由上對抗rhCNTF單抗。將CNio結(jié)合蛋白及rhCNTF陽性海生:工生物工程公司合成;mPEG- MAL 20kD購自對照分別用生理鹽水稀釋至1 μg/mL后再稀釋6個北京健凱科技有限公司;層析介質(zhì)來自GE-Health-梯度,以100 μL/孔加入96孔板進(jìn)行檢測。care公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.6.2小鼠體內(nèi)活性試驗采用小鼠體重增長抑制PCR擴(kuò)增儀PTC-200為BIO-RAD公司產(chǎn)品;凝膠掃法。將昆明鼠隨機(jī)分為3組,I組為生理鹽水,2組為描成像系統(tǒng)ImageQuantVDS、層析系統(tǒng)AKTAex-CN1o原液,3組為CNo-mPEG-MAL,按100 μg/kg 劑plorer為GE公司產(chǎn)品。量肌肉注射1針后每天稱量小鼠體重,按下式計算1.2 CNi突變體的構(gòu)建5 d小鼠體重增長抑制率!:以含人工合成的rhCNTF基因的重組質(zhì)粒pET/5 d小鼠體重增長抑制率(%)=rhCNTF為模板設(shè)計上下游引物，經(jīng)點突變在對照組5d平均體重-給藥組5d平均體重x100%對照組5d平均體重rhCNTF基因中引人一個半胱三酸位點,擴(kuò)增出突變基因CNo,經(jīng)Nde 1、Aor II雙酶切后用T, DNA連接2結(jié)果.酶插人經(jīng)同樣酶切處理的質(zhì)粒pET42b,以此連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布含卡那2.1重 組pET/CNo質(zhì)粒的酶切鑒定霉素的LB平板,37C培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌培養(yǎng)突變重組體pET/CNo質(zhì)粒經(jīng)Nde I、Aor II雙酶提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切判定陽性質(zhì)粒,將獲得的陽.切后產(chǎn)生一.條約560bp的目的基因片段和一條約性突變重組體記作pET/CNroo5500 bp 的載體片段,與理論結(jié)果相符(圖1)。1.3 突變體pET/CNo在大腸桿菌中的表達(dá)挑取陽性單克隆菌,接種于3 mL LB(含卡那霉2.2 CN。在大腸桿菌 中的表達(dá)及純化素)液體培養(yǎng)基中,37C培養(yǎng)至Dom為0.6時加入終將誘導(dǎo)6 h的CN。菌液進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果顯濃度1mmol/L的IPTG誘導(dǎo),繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心收示目的蛋白表達(dá)量約為40%,相對分子質(zhì)量約為21x10*(圖2)。離心收集菌體并超聲波破碎,包涵體集菌體,SDS-PAGE檢測CN。的表達(dá)水平。經(jīng)變性溶解后透析復(fù)性,G25脫鹽后用Qsepharose1.4 CNu的純化挑取表達(dá)量較高的陽性菌株放大至2000 mL體FF陰離子交換柱進(jìn)行純化，梯度解離,收集目的蛋積三角瓶培養(yǎng),以終濃度1 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo),離白,電泳掃描分析,純度可達(dá)95%以上(圖2)。心收集菌體,所得濕菌體用TE重懸,超聲波破碎,所.3 CN,與mPEG-MAL的結(jié)合及結(jié)合蛋白的純化得包涵體蛋白經(jīng)變性、透析復(fù)性、SephadexG25脫分別取反應(yīng)4和24h的樣進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié).果顯示,反應(yīng)24 h后,經(jīng)VDS掃描分析,結(jié)合物的比鹽、Q Sepharose FF等層析步驟進(jìn)行純化。M(x10)_ M_ 1 23 4 M M(x10)97.244.0200044.29.09505020.120251014.3. . _4.3中國煤化工圖1 pET/CNw的雙酶切圖譜THCNMH GM:DL2000 DNA marker; 1:pET/CNo的Nde I .Aur II雙酶切片段M:蛋白質(zhì)marker; 1,2:CNm培養(yǎng)菌液;3,4:純化的CNn蛋白梁凌宇等:重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的聚乙二醇化修飾6°例可達(dá)70%。反應(yīng)混合物經(jīng)Superdex200純化后,PEG連接位點的選擇,除此之外,修飾條件和副產(chǎn)物結(jié)合蛋白純度可達(dá)95%以上。結(jié)果見圖3 .4。的產(chǎn)生也會影響到蛋白的生物學(xué)活性。因此,選擇2.4CNo修飾產(chǎn)物的活性檢測合適的修飾位點和修飾方法就顯得至關(guān)重要。本實2.4.1 ELISA 活性CNo- mPEG- MAL的ELISA活驗室正在開展的rhCNTF的PEG化工作選擇巰基修性可達(dá)1:4000, rhCNTF陽性對照為1:16 000, 而飾是基于rhCNTF本身的特點,rhCNTF分子內(nèi)無二CNn原液可達(dá)1:32 000。結(jié)果表明CNo在PEG化后硫鍵,也無糖基化位點,因此在實驗設(shè)計之初就考慮ELISA活性明顯降低,與設(shè)計預(yù)期相符(表1)。在遠(yuǎn)離生物活性位點處引人半胱氨酸,以達(dá)到對2.4.2小鼠體內(nèi)生物活性小鼠肌肉注射CNo-rhCNTF的定點修飾。初步實驗結(jié)果表明,rhCNTFmPEG-MAL后48h內(nèi)體重增長抑制明顯,體重增長的突變體CNo可成功地經(jīng)mPEG-MAL進(jìn)行修飾,引抑制率可達(dá)50%,和CN。原液注射組相比有顯著差人一個半胱氨酸殘基之后,CNo的生物學(xué)活性無明異,5 d后CNn0-mPEG-MAL肌肉注射組體重增長抑顯降低,在PEG化修飾后,修飾產(chǎn)物也保留了較好的制率可達(dá)25%。結(jié)果表明CNu在PEG修飾后減重持生物學(xué)活性,生物學(xué)效應(yīng)明顯延長,實驗結(jié)果比較符續(xù)時間和體內(nèi)半衰期明顯延長(圖5)。合設(shè)計預(yù)期。有關(guān)rhCNTF在PEG化后的體內(nèi)半衰期和免疫原性的準(zhǔn)確評價,還有待更進(jìn)一步的藥代45.MM(x103)動力學(xué)研究才能確定。. 97.2表1 PEG-CNw的ELISA檢測結(jié)果44.0CNo- mPEG- -MAL 0.262 0.199 0.116 0.058 0.039 0.03529.0rhCNTF標(biāo)準(zhǔn)品0.651 0.576 0.357 0.167 0.068 0.042CNw原液1.553 1.468 1.374 1.134 1.117 0.751陰性值0.036 0.041 均值 :0.0385.14.3圖3 PEG-CNw的 SDS- PAGE分析+生理鹽水對照M:蛋白質(zhì)marker; 1:純化的PEG-CNo;2:反應(yīng)4 h的樣品;3:反應(yīng)24 h完成后的樣品;4,5:CNo單體e‘4- CN1o原液f- + PEG- CN1ot圖5 PEG-CNu的小鼠減重實驗結(jié)果參考文獻(xiàn)圖4 PEG-CNw的 RP-HPLC分析A相:含0.1% TFA的注射用水;B相:含0.1% TFA 的乙腈1] Inada Y, Furukawa M, Sasaki H, et al. Biomedical and bio-technological application of PEG- and PM- modified proteins3討論小Tibtech, 1995,13:86-91.2] Veronese F M. Peptide and protein PEGylation: a review ofproblems and solut ions[J]. Biomaterials, 2001 22:405-417.PEG化技術(shù)是一種非常有效的藥物長效化技3] Woghiren C, Sharma B, Stein S. Protected thiolpolyethylene術(shù),可用來解決或緩解蛋白質(zhì)和多肽類在藥用過程glycol: a new activa ted polymer fo reversible protein modif-中存在的諸多問題,比如半衰期短、存在免疫原性eation[J]. Bioconjugate Chem, 1993,4:314-318.等。但是,PEG化修飾的同時也可能會降低生物學(xué)4] 王良友,劉克良.多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法[].有活性,這也是PEG修飾面臨的最大難題。導(dǎo)致蛋白機(jī)化學(xué), 203211);1320-1323.的生物學(xué)活性降低的原因是多方面的,最主要的是5] 畢華，袁力勇，史新昌,等睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體蛋白的活性研究[J].中國生物工程雜志, 2007,27(1);1-5.中國煤化工MHCNM HG