西北植物學(xué)報(bào)2001,21(2):257—261Acta Bot. Boreal -Occident. Sin文章編號(hào):1000-4025-(2001)02-0257-05聚乙二醇對(duì)東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及紫杉醇生產(chǎn)的影響陳正山,王勤(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)和分子生物學(xué)系,蘭州730000摘要:在改良的B培養(yǎng)基中加入不同濃度的聚乙二醇對(duì)東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),通過(guò)不同時(shí)期取樣并測(cè)定細(xì)胞鮮、干重及用HPLC測(cè)定紫杉醇的含量。發(fā)現(xiàn)聚乙二醇對(duì)東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及紫杉醇生產(chǎn)均有明顯的促進(jìn)作用。聚乙二醇為10g/L時(shí),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最為有利,細(xì)胞培養(yǎng)16d就可達(dá)到最大生物量,其平均鮮重為28.73g/瓶,增重3.8倍,平均干重為2.14g/瓶,增重3.1倍。聚乙二醇為20g/L時(shí),對(duì)紫杉醇的生產(chǎn)最有利,細(xì)胞培養(yǎng)25d時(shí),培養(yǎng)基中紫杉醇的含量達(dá)到最高水平,其含量為2350μg/-,是不加聚乙二醇的11倍關(guān)鍵詞:東北紅豆杉;紫杉醇;聚乙二醇;高壓液相色譜儀中圖分類號(hào):Q946.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AEffects of polyethylene glycol on cell growth and taxolproduction in suspension cultures of Taxus cuspidataChEn Zheng-shan, WANG QinDepartment of Biochemistry and Molecular Biology. School of Life Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)Abstract: Cells of Tarus cuspidata were suspensively cultured in modified B, mediumsupplemented with different concentration PEG(Polyethylene glycol). Great effects ofPEG on cell growth and taxol production were observed by determining fresh weight anddry weight of cells and taxol contents中國(guó)煤化工 C at different days ofculture. 10 g/L PEg is the best concentraCNMHG highest biomass wasachieved in 16 day's culture with 28. 73 g/flask of fresh weight and 2. 14 g/flask of dryweight, which increasing 3. 8 times and 3. 1 times respectively. 20 g/L Peg is good for01;修改稿收到日期:2000-05-291975-),男(漢族),碩士通訊聯(lián)系人:王勤。 CorresWANG258西北植物學(xué)報(bào)accumulation of taxol. Taxol concentration in medium amounted to the highest levelswith 2 350 ug/L when the cells were cultured for 25 days, which is 11 times of that ofPEG-freeKey words Tarus cuspidata; taxol; PEG; HPLC紫杉醇( Taxol)是從紅豆杉屬(TaαwsL.)植物中分離得到的一種二萜烯類化合物3,它是一種新型、高效、廣譜抗癌藥物,特別是對(duì)卵巢癌、乳腺癌、肺癌有較好的療效?，F(xiàn)在市場(chǎng)上供應(yīng)的紫杉醇主要從紅豆杉樹皮中提取,但是樹皮中的紫杉醇含量極低(0.01%),僅靠樹皮來(lái)提供紫杉醇難于滿足市場(chǎng)需要,而且長(zhǎng)期砍伐紅豆杉樹又會(huì)導(dǎo)致資源枯竭,破壞生態(tài)平衡。因此,目前紫杉醇價(jià)格比較昂貴,一般患者難于支付。為滿足社會(huì)對(duì)紫杉醇的需求,開辟新藥源已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),其中利用細(xì)胞工程法生產(chǎn)紫杉醇是一種行之有效的方法自 Christen等1991年獲得紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的第一個(gè)專利以來(lái)8,有關(guān)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)生產(chǎn)紫杉醇的研究已取得巨大進(jìn)展10,但如何降低成本、提高產(chǎn)量一直是人們討論的熱點(diǎn)。我們?cè)噲D利用PEG大分子反滲透法誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物向細(xì)胞外排放的原理,將PEG應(yīng)用于東北紅豆杉( Tarus cuspidata)細(xì)胞培養(yǎng),用以提高培養(yǎng)細(xì)胞的生物量和紫杉醇的化學(xué)量,而到目前為止,有關(guān)這方面的研究還未見過(guò)報(bào)道。本文初步研究PEG對(duì)東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及紫杉醇生產(chǎn)的影響1材料和方法1.1材料外植體取自本試驗(yàn)室栽培的東北紅豆杉幼苗的幼嫩莖段,用改良的B3培養(yǎng)基誘導(dǎo)成愈傷組織后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品, Sigma公司生產(chǎn),純度為97%;PEG為廣東汕頭化工廠生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品,分子量為6000;培養(yǎng)基為我們?cè)O(shè)計(jì)的改良B3培養(yǎng)基,即B3基本培養(yǎng)基附加5mg/LNAA、3mg/L6-BA、2ng/L2,4-D、0.2mg/LKT、1g/L水酪蛋白解( Sigma)、1g/L甜菜堿( Sigma)、10g/LPVP( Polyvinylpyrrolidone)和30g/L蔗糖,pH值5.81.2細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)參數(shù)的測(cè)定1.2.Ⅰ細(xì)胞培養(yǎng)用改良的B3培養(yǎng)基將傳代培養(yǎng)24代的東北紅豆杉莖愈傷組織配制成6g/100mL的細(xì)胞液,然后每250mL三角瓶中裝100mL細(xì)胞液,即接種鮮重為6g/瓶(誤差小于0.2g),接種干重為0g/L、25g/L和30g/L.6個(gè)不同濃度的PYH中國(guó)煤化工1、10g/L-、15g/L、20CNMHG為對(duì)照,于25C±1C下暗處搖瓶培養(yǎng)28d,轉(zhuǎn)速為120r/min。1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)參數(shù)的測(cè)定培養(yǎng)第4天開始取樣,以后每隔3d取樣1次,每次每個(gè)梯度重復(fù)取樣3次。收集細(xì)胞,并稱量鮮重,記錄鮮重和平均鮮重,于恒溫烘箱中40C烘干至恒重錄遭和平均干重。鮮、干重顯著性分析用單因素方差分析法。細(xì)胞增長(zhǎng)倍數(shù)一(最大生物量一接種量)/接種量2期陳正山等:聚乙二醇對(duì)東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及紫杉醇生產(chǎn)的影響1.3紫杉醇的提取及HPLC測(cè)定1.3.Ⅰ培養(yǎng)基中紫杉醇的提取量取50mL培養(yǎng)基,用CHCl2按1:1配比(培養(yǎng)基:CH2Cl2)萃取3次,合并CHCl2部分,用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海生化儀器廠)在45C±1C下濃縮至干。所得粗提取物用CHO定溶至5mL,然后用HPIC測(cè)定紫杉醇含量。1.3.2細(xì)胞中紫杉醇的提取干細(xì)胞經(jīng)碾碎后用100μm的濾網(wǎng)濾出細(xì)胞干粉,稱取1g細(xì)胞干粉,用50 mL CHO浸泡3次,每次先用超聲波振蕩15min后繼續(xù)浸泡過(guò)夜。濾出CHO部分,在80C±1C下用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。所得粗提物先用50mL蒸餾水溶解,然后加λ5 0 mL CH, Cl2萃取3次,后面其它操作和提取培養(yǎng)基中紫杉醇的相同。1.3.3HPLC檢測(cè)高壓液相色譜儀: Waters510泵,991二極管矩陣檢測(cè)器;柱長(zhǎng)15cm,內(nèi)徑3.9mm;流動(dòng)相:甲醇:CHCN:水=29:27:44;固定相:4uC18;溶劑:甲醇;檢測(cè):Uv227nm;進(jìn)樣量:10μL;流速:1.0mL/min;標(biāo)準(zhǔn)品:紫杉醇( Sigma);保留時(shí)間2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1PEG濃度對(duì)東北紅豆杉莖愈傷組織生長(zhǎng)的影響經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),PEG對(duì)東北紅豆杉莖愈傷組織的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。鮮、干重差異均達(dá)到極顯著水平(表1)。PEG濃度為10g/L時(shí),對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)最有利表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)快速,褐化程度低,細(xì)胞呈微黃色,分散比較均勻,大多以單細(xì)胞或微小細(xì)胞團(tuán)為主(顯微鏡觀察)。細(xì)胞培養(yǎng)16d就可達(dá)到最大生物量,其平均鮮重為28.73g/瓶,增重3.8倍,平均干重為2.14g/瓶,增重3.1倍(表1)。當(dāng)PEG濃度小于或等于10g/L時(shí),隨PEG濃度的增加,細(xì)胞平均鮮、干重呈上升趨勢(shì),而PFG濃度大于10g/L時(shí),情況剛好相反(圖1)表IPEG濃度對(duì)東北紅豆杉莖愈傷組織生長(zhǎng)的影響及差異顯著性分析(培養(yǎng)16d)Table 1 Influence of PEG on cell growth and statistical analyses(cultured for 16 daysPEG濃度平均鮮重平均鮮重增長(zhǎng)倍數(shù)平均干重平均干重增長(zhǎng)倍數(shù)PEG concentrati(g/L)g/flaskgrowth index11.18±0.620.89±0.014.63±11.18±0.081.2528.73±1.133.802.14士0.0824.88±1.2919.88±0.37311.59±0.0215.26±0.591.541.14±0.0310.21±1.230.67±0.08鮮重方差分析YH中國(guó)煤化工F重方差分析FW SCNMHG101,8臨界值alue差異極顯著差異極顯著ance西北植物學(xué)報(bào)20002.50.515202530101316192225PEG(/L)圖1PEG濃度對(duì)東北紅豆杉莖圖2PEG為20g/L時(shí)培養(yǎng)基中愈傷組織最大生物量的影響紫杉醇的積累曲線Fig. 1 Influence of PEG on theFig 2 Accumulation curves of Taxol inmedium supplemented with 20 g/L PEG2.2PEG對(duì)紫杉醇生產(chǎn)的影響PEG對(duì)紫杉醇的生產(chǎn)也有明顯的影響。當(dāng)濃度為20g/L時(shí),對(duì)紫杉醇的生產(chǎn)最有利表2)。培養(yǎng)10d時(shí)在培養(yǎng)基中開始檢測(cè)到紫杉醇,其含量為43μgL(圖2),培養(yǎng)25d時(shí)培養(yǎng)基中紫杉醇積累達(dá)到最高峰,其含量為2350g/L(圖2、圖3),是對(duì)照組中紫杉醇含量的11倍。PEG濃度小于或等于20g/L時(shí),對(duì)細(xì)胞中紫杉醇含量無(wú)明顯影響但PEG濃度大于20g/L時(shí),細(xì)胞和培養(yǎng)基中紫杉醇含量均呈下降趨勢(shì)(表2)表2PEG濃度對(duì)紫杉醇生產(chǎn)的影響(培養(yǎng)25d)Table 2 Influence of PEG on Taxol production (cultured for 25 days)PEG濃度PEG concentrations30胞外紫杉醇Extracellular taxol690內(nèi)紫杉醇(ug/g Dw)3討論P(yáng)EG是一種高分子量有機(jī)化合物,植中國(guó)煤化工比大分子的物質(zhì)。PEG的主要作用是改變細(xì)胞膜的微結(jié)構(gòu),從YHCNMHG為高滲劑。因此,理論上講,向東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中加入一定濃度的PEG可促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用,從而有利于細(xì)胞生長(zhǎng),PEG改變細(xì)胞膜的微結(jié)構(gòu)則有利于紫杉醇的釋放,較高濃度的PEG提高培養(yǎng)體系秀搪又可進(jìn)一步促進(jìn)紫杉醇向細(xì)胞外排放。本實(shí)驗(yàn)就是根據(jù)這一原理來(lái)設(shè)計(jì)的2期陳正山等:聚乙二醇對(duì)東北紅豆杉培養(yǎng)細(xì)跑的生長(zhǎng)及紫杉醇生產(chǎn)的影響2611290.7853.856.0753.515.03HPLC圖譜PEG為20g/L時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)25d紫杉醇的積累達(dá)到最高水平,其含量為2350g/LFig 3 HPLC determinationThe highest amount of Taxol was 2350 pg/l. when cells were cultured in medium supplemented with 20 g/I. PEG for 25 days本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的PEG對(duì)東北紅豆杉莖愈傷組織的生長(zhǎng)及紫杉醇的生產(chǎn)具有不同的影響。其中10g/LPEG為細(xì)胞生長(zhǎng)最適濃度,細(xì)胞培養(yǎng)16d就可達(dá)到最大生物量,其平均鮮重增加了3.8倍,平均干重增加了3.1倍。PEG為20g/L則有利于培養(yǎng)基中紫杉醇的積累,培養(yǎng)25d時(shí)培養(yǎng)基中紫杉醇的積累達(dá)到最高水平(和 Penstechanker等報(bào)道的24d達(dá)到最高峰基本一致),其含量為2350g/L。本研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)PEG濃度為20g/L時(shí),96%的紫杉醇都積累在培養(yǎng)基中,這給紫杉醇的分離提純帶來(lái)了方便。目前,雖然通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)生產(chǎn)紫杉醇的研究已取得巨大進(jìn)展10,但離商業(yè)化生產(chǎn)還有段距離。其主要原因是目前培養(yǎng)細(xì)胞的生物量和紫杉醇的化學(xué)量還未達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平的要求θ因此,本研究為今后有關(guān)提高培養(yǎng)細(xì)胞的生物量和紫杉醇的化學(xué)量方面的研究及紫杉醇的商業(yè)化生產(chǎn)提供了有益的參考參考文獻(xiàn)[1 ELLIS DD, ZELDIN E L, BRODHAGEN M, et al. Taxol production in Nodule cultures of Taxus[J] Journal ofNatural Products, 1996, 59(3): 226-2502]李家儒,曹孟德,劉曼西等前體物對(duì)紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇生物合成的影響[].植物學(xué)研究,199,19(3)[3 THOMAS J H, LUIS J P, VENKATEST S,et al. Taxol production in suspension cultures of Tarus baccata[J]Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1996, 44: 99-102.4]孫彬賢,章國(guó)瑛,劉滌,等.紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)與紫杉醇生產(chǎn)[J].植物生理學(xué)通訊,1999,35(2):135-140.[5 COLLINS-PAVAO M. CHIN C K, PEDERSEN H. Taxol portitioning in two-phase plant cell cultures of Tazusbrevifolia[J] Journal of Biotech,1996,49: 95-1006]黃遵錫,慕躍林,周玉敏,等,發(fā)根農(nóng)杄菌對(duì)短葉紅豆杉的轉(zhuǎn)化及毛狀根中紫杉醇的生產(chǎn)匚].云南植物硏究1997,19(3):292-296.7]甘煩遠(yuǎn),鄭光植.紅豆杉的細(xì)胞工程學(xué)研究進(jìn)展[中國(guó)煤化工4:156159.[8 CHRISTEN AA, GIBSON D M. BLAND J PrPounds in cell cultures[P].USPatent5019504,1991CNMHG[9] KINGSTON DG L. Taxol: The chemistry and structure-activity relationships of a novel anticancer agent [J]1θ]邢建民,査麗杭,李佐虎,等.植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進(jìn)展[].植物學(xué)通報(bào),1997,14(3):22-29.[11 LUIS J. PENSTECHANKER SC. ROBERTS, et aL. Kinetics of taxol production and nutrient use in suspension