2010年7月四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)July. 2010第47卷第4期Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)Vol. 47 No. 4doi:103969/j. issn. 0490-6756. 2010.04. 034膽固醇-聚乙二醇胰島素偶聯(lián)物的合成楊莉'，伍曉春’，錢珊'，趙敏'，吳勇1(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都610041;.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，成都610066)摘要:選擇了胰島素受體為作用靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了用于新型肝靶向藥物傳遞系統(tǒng)的脂質(zhì)體配體，以賦予脂質(zhì)體的雙重靶向性.以聚乙二醇2000(2)和膽固醇衍生物(3)為起始原料,經(jīng)過Williamson成醚反應(yīng)、?；磻?yīng),最后與胰島素縮合得目標(biāo)化合物(1).所得目標(biāo)物(1)分子量經(jīng)MALDI-TOF確證.關(guān)鍵詞:肝靶向藥物;胰島素受體;脂質(zhì)體配體;合成中圖分類號(hào): R914文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A文章編號(hào): 0490-6756(2010>04-0859-04Synthesis of cholesterol-polyglycol-insulin conjugateYANG Li', WU Xiao Chun2 ,QIAN Shan'，ZHAOMin', WU Yong'(1. School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China;2. Chemistry and Material Collge, Sichuan Normal University, Chengdu 610066, China)Abstract: Insulin receptor was chosen for targeting site, a new kind of ligand for liposome in drug deliv-ery system was designed and synthesized to endue dual functions of the liposome. PEG2000 was chosenas starting material, after etherficiation by Williamson etherficiation reaction, acylation, conjugationwith insulin to obtain the target compound. The molecule weight of the ligand was confirmed by MAL-DI- TOF.Key words: hepatic targeting drug, insulin receptor, ligand of liposome, synthesis系統(tǒng)中主動(dòng)靶向脂質(zhì)體的制備,成為發(fā)展以受體介1引言導(dǎo)的脂質(zhì)體治療肝臟疾病的關(guān)鍵.脂質(zhì)體在許多肝臟疾病的治療和診斷中顯示胰島素受體是存在于肝細(xì)胞膜上的- -類特異出明顯的優(yōu)越性,受到了廣泛的關(guān)注”1.然而傳統(tǒng)性受體,當(dāng)人肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí),其肝細(xì)胞表面的的脂質(zhì)體仍然存在靶向分布不理想、穩(wěn)定性較差等胰島素受體大量增加,為正常肝細(xì)胞膜表面的532缺點(diǎn),因此限制了脂質(zhì)體在肝臟疾病治療領(lǐng)域中的倍,所以胰島素受體是一個(gè)將藥物靶向?qū)说礁渭?xì)應(yīng)用.近年來,通過對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行特異性修飾，胞的一個(gè)理想靶標(biāo)[3].我們?cè)趪鴥?nèi)外首次提出制備賦予其主動(dòng)靶向的特征,使其能夠靶向到肝臟[2].一類肝靶向脂質(zhì)體的新型配體,即胰島素橋膽固但仍存在靶向性不夠的問題,其原因在于缺乏一種醇分子(1,見圖1),此類新型配體的特點(diǎn)是利用膽具有良好靶向性的脂質(zhì)體配體.因而設(shè)計(jì)并合成這固醇PEG-胰島素偶聯(lián)物的脂溶性膽甾部分嵌人樣一種新型的脂質(zhì)體配體,以用于肝靶向藥物傳遞到陽離子脂質(zhì)體雙層分子中,使胰島素暴露在脂質(zhì)收稿日期: 2009-07-15中國煤化工基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(30672537);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(200506 I作者簡(jiǎn)介:楊莉(1985 -),女,四川大學(xué)華西藥學(xué)院2007級(jí)碩士研究生.YHCNMH G通訊作者:吳勇. E mail: wyong@ scu. edu. cn.860四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第47卷體表面,從而可識(shí)別肝癌細(xì)胞表面的胰島素受體..將會(huì)與肝細(xì)胞膜上特異性的胰島素受體結(jié)合,從而這種脂質(zhì)體配體可用于制備主動(dòng)靶向脂質(zhì)體并包將藥物定向在肝臟釋放以增強(qiáng)其治療作用,降低藥裹藥物，如阿霉素、順鉑等.可以設(shè)想,此類具有肝物對(duì)其他靶點(diǎn)毒副作用.靶向性的脂質(zhì)體在包裹藥物分子并進(jìn)人體內(nèi)之后，人ins圖1化合物1的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of Compound 1本文選擇了以胰島素受體為作用靶點(diǎn),設(shè)計(jì)并固醇衍生物(3)[國在NaH的作用下醚化成醇(4)，合成了用于新型肝靶向藥物傳遞系統(tǒng)的脂質(zhì)體配隨后醇(4)與丁二酸酐在吡啶中?；玫疥P(guān)鍵中間體(1).目標(biāo)化合物(1)的合成以聚乙二醇2000(2)體(5).最后,酸(5)和胰島素縮合得目標(biāo)化合物和膽固醇衍生物(3)為起始原料，其合成路線見圖(1).2.首先,聚乙二醇2000(2)和我們先前已報(bào)道的膽PEG2000 +NaH,DMSO+MotahorHot~yor3|ox°po，PyrHCI COOBu' ,n-Bu.Nins!toen圖2膽固醇-PEG胰島素偶聯(lián)物(1)的合成路線Fig.2 Synthetic Route of Conjugate 1里，2儀器及試劑'H-NMR用Varian INOV A(400MHz)(美國3實(shí)驗(yàn)方法Varian公司);IR用Perkin Elmer 983型紅外儀，3.1化合 物(4)的合成KBr壓片測(cè)定;質(zhì)譜儀器用BIFLEX II 型MAL-將PEG2000(2)(4 g，2 mmol)充分干燥并抽DI-TOF質(zhì)譜儀(BrukerDaltonics公司).電泳純真空之后,Ar保護(hù)下,加入干燥的DMSO和THF化儀器為PROTEINI型垂直板電泳儀(BioRad各10mL,隨后迅速tm人60%的每化鈉,室溫活化公司).實(shí)驗(yàn)中所用為豬胰島素購于徐州萬邦生化0.5 hr后，將治YH中國煤化工合物(3)( .股份公司,其他試劑均為分析純，溶劑均經(jīng)無水處(320 mg, 0. 5CNM.HGp,60 C反.第4期楊莉等:膽固醇-聚乙二醇-胰島素偶聯(lián)物的合成861應(yīng)8 hr,冷卻,將反應(yīng)液傾入到50 mL冰水中,二Hz)，0.85 (d, 6 H, CH3-26 and CH3-27, J25,26 .氯甲烷100 mL分三次提取,合并提取液，無水= J25.27= 6.5 Hz), 0.66 (s, 3H, CH3-18); IRNa2SO,干燥,過濾,旋干得油狀物,經(jīng)硅膠快速柱(u)cm~ 1 UoH 3446, 2870, u(C=O)1750, u(C=C)層析分得黃色油狀物0. 64 g,收率48%. HNMR:1647，v[CH(CH3);] 1457， u(O=C- CH2 )5.34 (m, 1 H, chol H-6), 3.74~3.60 (m, a. b. .1350，uv(C- O) 1104， 952.160 H, 80XCH2O)，3.20 (m, 1 H, chol H-3)，3.3化合物(1)的合 成2.33~0.66 (remaining chol protons) with 0. 99.將化合物(5)200 mg溶解于pH為8.6的硼(s，3H, CH3-19),0.91 (d, 3 H, CH3-21, J20.21酸 緩沖溶液中,隨后依次加入氯甲酸異丁酯和三丁= 6.6 Hz), 0.85 (d, 6 H, CH3-26 and CH3-27，胺各0. 05 mL,冰浴下活化反應(yīng)0.5 hr,隨后加入J2,26= J25.27= 6.5 Hz)，0.66 (s，3 H, CH3-溶解于2 mL硼酸緩沖溶液的胰島素,4 C下反應(yīng)18); IR(u)cm 'v(O- H) 3445, v(C- - H) 2871, u24 hr[5]. 將反應(yīng)液冷凍干燥，以SephadexG-50初(C=C) 1647， v[CH(CHz)z] 1467, u(O=C- -步純化蛋白質(zhì),經(jīng)過G-50葡聚糖凝膠柱初步純CH2) 1352, v(O- H)1106, 952.化,除去了大部分的小分子物質(zhì).將上述凝膠層析3.2化合物(5)的合成所得的反應(yīng)液用截留量為6000Da的透析袋進(jìn)行將PEG2000-膽固醇(4)(0.2 g, 0. 079 mmol)透析,以0.9%的生理鹽水為透析外液,待大部分與丁二酸酐(160 mg, 0. 158 mmol)混合后,抽真的鹽及小分子透析完畢后,冷凍干燥,得白色粉末空,氬氣(Ar)保護(hù)下,加入干燥的吡啶16 mL,加狀固體.目標(biāo)化合物的分子量MODLIA-TOFMS:熱回流反應(yīng)過夜后,旋干溶劑，殘余物經(jīng)硅膠快速[8423 -8610].柱層析分得黃色油狀物70mg，收率在通過G-50和透析袋初步純化的基礎(chǔ)上,我35%. ' HNMR: 10.2 (1 H, COOH ), 5. 34 (m,們進(jìn)一步嘗試采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法來1 H, chol H-6), 3.83 ~3.15 (m, a.b. 160H, 80驗(yàn)證是否有新化合物產(chǎn)生.按文獻(xiàn)方法[6]進(jìn)行電XCH2O)，3. 20 (m, 1 H, chol H-3)， 2. 33~泳,結(jié)果顯示圖中僅有一條電泳帶的是純的豬胰島0.66 (remaining chol protons) with 0. 99 (s, 3H,素，顯示兩條帶的是偶聯(lián)物(見圖3).CH3-19)，0. 91 (d, 3 H，CH3-21， J20.21= 6. 6圖3偶聯(lián)物與胰島素的電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram of the Conjugate 1 and Insulin為縮合劑的反應(yīng)條件下反應(yīng)”;室溫條件下在0.01.4結(jié)果與討論mol/L鹽酸溶液中反應(yīng)[間;以及先將膽固醇羧酸與在合成偶合物(1)時(shí),曾嘗試用n=2~5的化HOBt在SOCl2中反應(yīng)先生成活性酯,再與胰島素合物(5)與胰島素偶聯(lián)，但未得到目標(biāo)產(chǎn)物(經(jīng).在pH為8.4的磷酸鹽緩沖溶液中偶聯(lián)的方法[0]，HPLC檢測(cè),這些反應(yīng)均未有除胰島素外的新峰產(chǎn)但HPLC顯示除豬胰島索的峰外,未見新的峰.最生).分析原因可能是由于胰島素為水溶性物質(zhì),縮后,我們采用在pH為8.6的硼酸緩沖溶液中反合反應(yīng)必須在水中進(jìn)行,而n=2~5的化合物(5)應(yīng),經(jīng)HPLC檢測(cè)，顯示有新化合物的峰出現(xiàn),經(jīng)的膽甾部分所占比例大,整個(gè)化合物水溶性差,在結(jié)構(gòu)鑒定確證為偶合物(1).同時(shí)MODLIA-TOF水中縮合時(shí)不反應(yīng).因此,我們采用含氧原子更多、質(zhì)譜顯示沒有小的分子離子峰,證實(shí)胰島索的肽鍵水溶性更好的PEG2000與胰島素在水中縮合.我沒有斷裂.中國煤化工們對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的條件也進(jìn)行了摸索,先后采用了在本文設(shè)計(jì)HCNMH G00-胰島素4°C,pH為8.4的磷酸鹽緩沖溶液,EDC/HOBt偶聯(lián)物,該偶聯(lián)物可用于具有雙重靶向作用的肝靶.862四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).第47卷向脂質(zhì)體的制備.該設(shè)計(jì)思想的成功,為肝靶向藥terylated carboxylic acids with oligo ( polyethylene物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供了一種新型材料,為藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)靶g(shù)lycols) units for gene delivery [J]. 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