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編譯：微科盟 艾奧里亞 ，編輯：微科盟茗溪、江舜堯。

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在為期14 d的培養(yǎng)周期中，有14.5%的阿特拉津在無菌土壤（經(jīng)過滅菌的土壤）中被去除，這一結(jié)果表明 非生物因素對阿特拉津僅存在有限的去除效應 （圖1）。與無菌土壤相比，生物強化處理（Atr-Bio）中阿特拉津的濃度顯著降低。在培養(yǎng)結(jié)束時，阿特拉津在阿特拉津處理（Atr）和生物強化處理（Atr-Bio）的去除率分別為28.3%和97.9%。此外，Atr-Bio處理中阿特拉津的DT ₅₀ 和DT ₉₀ 值分別為1.2 d和3.9 d。這些結(jié)果表明， 土著微生物對阿特拉津的去除貢獻不大，AT-5菌株主導了土壤中阿特拉津的去除 （ p  < 0.01）。

圖1 不同土壤樣品中阿特拉津的隨時間的去除及接種外源菌株后土壤微環(huán)境中trzN的qRT-PCR定量結(jié)果。 對照（Control）代表加標阿特拉津的原始土壤；滅菌土壤（Sterilized soil）代表加標阿特拉津的滅菌土壤；生物強化（Bioaugmentation）代表接種AT-5菌株的加標阿特拉津的土壤；以trzN的基因拷貝代表trzN的定量結(jié)果（g ^-1 干燥土壤）。

通過qRT-PCR的方法，我們通過定量初始水解酶基因 trzN 的拷貝數(shù)，計算了土壤中接種的AT-5菌株的豐度（圖1）。PCR閾值標準曲線擴增效率為98.4%。在生物強化處理中， trzN 基因的拷貝數(shù)在前7天內(nèi)下降，隨后保持相對穩(wěn)定直至培養(yǎng)結(jié)束（14 d），而 trzN 基因不能用未經(jīng)任何處理的原始土壤樣本中提取的DNA模板進行擴增。說明 接種AT-5菌株在土壤中能很好地存活一段時間 （14d）。

土壤中高、低濃度的阿特拉津均對甘薯幼苗能夠顧產(chǎn)生藥害效果（補充圖S2）。在21 d栽培期內(nèi)，盡管甘薯幼苗能在低濃度阿特拉津（0.2mg kg ^-1 ）存在的土壤中存活，但仍可觀察到藥害現(xiàn)象，諸如葉片發(fā)黃等。這表明甘薯幼苗對阿特拉津敏感，即使低濃度的阿特拉津殘留在土壤中，也會影響后續(xù)作物的種植。因此，我們在加標阿特拉津的處理14 d的剩余土壤樣本（Atr）以及加標阿特拉津且接種AT-5菌株的處理14 d的剩余土壤樣本（Atr-Bio）中再次種植甘薯幼苗。此時，Atr和Atr-Bio土壤中殘留的阿特拉津濃度分別為3.36 ± 0.62和0.09 ± 0.002 mg kg ^-1 。阿特拉津加標土壤（Atr）對甘薯幼苗造成嚴重的藥害效應，甘薯幼苗在培養(yǎng)21 d后死亡。而甘薯幼苗在加標阿特拉津且接種了AT-5菌株的土壤中生長良好（Atr-Bio；圖2）。這些結(jié)果進一步表明， AT-5菌株的生物強化可有效去除土壤中的阿特拉津，并可防止阿特拉津殘留對后續(xù)作物的損害。

圖2 通過生物強化減輕了阿特拉津?qū)Ω适碛酌绲乃幒Α?/span> 對照（Control）代表培養(yǎng)14天后的加標阿特拉津的原始土壤，該土壤個樣本中阿特拉津的濃度為3.36 ± 0.62 mg kg ^-1 。生物強化（Bioaugmentation）：培養(yǎng)14天后的加標阿特拉津且接種了AT-5菌株的土壤，該土壤樣本中阿特拉津的殘留濃度為0.09 ± 0.002 mg kg ^-1 ，每個處理設3個重復。

通過16S rRNA-擴增子測序，我們進一步探討了不同處理下的土壤樣本在第0、1、3、7以及14 d時土壤細菌群落的變化情況。在α-多樣性方面，與Atr-Bio處理（接種AT-5菌株的阿特拉津土壤）和Bio處理（接種AT-5菌株的原始土壤）相比，對照處理（甲醇和ddH ₂ O處理）表現(xiàn)出更高的群落豐富度（表現(xiàn)為較高的Chao1指數(shù)和OTU數(shù)量）和多樣性（表現(xiàn)為較高的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）（圖3）。此外，未接種AT-5菌株但引入了阿特拉津的處理組（Atr處理）降低了土壤群落豐富度，而對群落多樣性影響不大（圖3）。說明 接種降解菌AT-5菌株顯著影響了土壤中細菌群落的豐富度和多樣性。

基于主坐標分析（PCoA）和層次聚類分析，我們進一步探究了AT-5菌株的接種和阿特拉津的引入對土壤細菌群落的影響。根據(jù)不同的處理和時間，我們將土壤樣品分為兩個不同的集群：接種處理（Atr-Bio和Bio）和非接種處理（Control和Atr；圖4A）。此外，通過分層聚類分析我們也發(fā)現(xiàn)了土壤樣本之間存在明顯的分離，其表現(xiàn)為接種處理和其他處理之間較大的距離（補充圖S5）。這些結(jié)果表明， 接種AT-5菌株主導了土壤中細菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的變化，而阿特拉津的引入對細菌群落幾乎沒有影響。

圖3 細菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)。 （A）代表菌株AT-5的相對豐度；（B）代表本研究所觀察到的OTU數(shù)量；（C）代表Chao1指數(shù)；（D）代表Shannon指數(shù)；（E）代表Simpson指數(shù)。對照代表向原始土壤中加入等量甲醇和ddH ₂ O；Atr代表加標阿特拉津的原始土壤；Atr-Bio代表加標阿特拉津且接種了AT-5菌株的土壤；Bio代表加標AT-5菌株的原始土壤。

圖4 不同處理對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。 （A）以基于Bray-Curtis距離對土壤細菌群落進行的主坐標分析（PCoA）；（B）代表不同土壤樣本中，在門水平上上細菌相對豐度的分層聚類分析。對照代表向原始土壤中加入等量甲醇和ddH ₂ O；Atr代表加標阿特拉津的原始土壤；Atr-Bio代表加標阿特拉津且接種了AT-5菌株的土壤；Bio代表加標AT-5菌株的原始土壤。

在所有處理中，豐度較高的細菌門包括放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidota）（圖4B）；在屬水平上， Paenarthrobacter 、 Pseudarthrobacter 和類諾卡氏菌屬（ Nocardioides ）是主要優(yōu)勢細菌屬（補充圖S6）。其中， Paenarthrobacter 屬是接種處理組中的主要優(yōu)勢屬，其豐度在Atr-Bio處理中保持相對穩(wěn)定（1、3、7、14 d分別為21.1%、15.3%、13.0%、17.9%）。這些結(jié)果結(jié)合qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示， 本研究所接種的 Paenarthrobacter sp. AT-5菌株在土壤中穩(wěn)定存活 （圖1，3A；補充圖S6）。

為了確定區(qū)分不同處理的生物標志物，基于LEfSe分析（補充圖S7），我們在所有水平上共檢測到58種潛在的生物標志物。在屬水平（圖5A）， Paenarthrobacter 和芽孢桿菌屬（ Bacillus ）是Bio和Atr-Bio處理（接種處理）中的潛在生物標志物。此外， 接種處理中芽孢桿菌的豐度顯著增加，表明接種 Paenarthrobacter sp. AT-5菌株在土著微生物群中富集了芽孢桿菌屬。 同時，與其他處理相比，在接種處理中，包括 Marmoricola 、類諾卡氏菌屬、壤霉菌屬（ Agromyces ）和 Solirubrobacter 在內(nèi)的17種其他潛在生物標志物的相對豐度降低。這些結(jié)果表明，接種處理在土著微生物群的選擇中對這些菌屬進行了負選擇。值得注意的是，包括 Marmoricola 、類諾卡氏菌屬、壤霉菌屬和 Solirubrobacter 在內(nèi)的生物標志物，僅在14天時，在加標阿特拉津處理的土壤（Atr）中被檢測到。與第1、3和7天相比，這些細菌屬的豐度第14天的Atr處理組中顯著增加。這表明，這4個屬可能是非接種處理中阿特拉津降解的陽性生物標志物。

圖5 以熱圖的形式展示了不同處理組在屬水平（A）和科（B）水平上對差異豐度細菌的LEfSe分析。 對照代表向原始土壤中加入等量甲醇和ddH ₂ O；Atr代表加標阿特拉津的原始土壤；Atr-Bio代表加標阿特拉津且接種了AT-5菌株的土壤；Bio代表加標AT-5菌株的原始土壤。Atr-Bio_Bio代表Atr-Bio處理與Bio處理的比較，Control_Atr代表對照組與Atr處理的比較。0-5天代表早期；7-14天代表晚期。

通過構(gòu)建細菌共生網(wǎng)絡，我們對不同處理組（Control、Atr、Bio和Atr-Bio）中細菌群落的共生模式進行了分析。Atr-Bio和Atr網(wǎng)絡之間共生模式的拓撲性質(zhì)差異顯著（圖6）。 與其他處理組的共生網(wǎng)絡相比，Atr網(wǎng)絡表現(xiàn)出更多的節(jié)點和邊緣，更高的平均度和平均聚類系數(shù)，以及更高的密度和連通性，這表明Atr網(wǎng)絡比Atr-Bio網(wǎng)絡具有更大的復雜性和連通性 （補充圖S8）。此外，正相關在所有網(wǎng)絡中占據(jù)主導地位，這與不同的處理無關。然而，與Atr處理（10.2%）相比，Bio（5.9%）和Atr-Bio（3.5%）處理所構(gòu)建的網(wǎng)絡中的負相關顯著降低。Atr網(wǎng)絡中較高的負相關性可能歸因于阿特拉津引入對非適應性細菌的過濾。在Atr-Bio網(wǎng)絡中，較低的負相關性可能歸因于生物強化去除了阿特拉津，并恢復了細菌群落。

圖6 不同處理條件下的細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡。 （A）代表對照處理（向原始土壤中加入等量甲醇和ddH ₂ O）；（B）代表Atr處理（加標阿特拉津的原始土壤）；（C）代表Bio處理（接種AT-5菌株的阿特拉津加標土壤）；（D）代表Atr-Bio處理（接種AT-5菌株的天然土壤）。

自然環(huán)境中的微生物群落通常沒有降解有機污染物的能力。 生物強化是一種接種特定功能的微生物用于降解污染物的策略，已被提出作為清理污染物污染場所最有潛力的方法。 盡管已有的研究探究了阿特拉津降解菌株對阿特拉津污染場地的生物強化作用，但關于生物強化對土著土壤微生物群落影響的研究很少。盡管如此，外源菌株的接種可能會顯著改變土壤微生物群的結(jié)構(gòu)，影響其潛在功能。為了確定生物強化是否具有負環(huán)境效應，需要對接種的外源菌株、污染物和土壤微生物之間的相互作用進行研究。本研究通過接種 Paenarthrobacter sp. AT-5菌株對阿特拉津進行去除，以探討生物強化對土壤微生物群的影響及微生物群落的重建過程。

在本研究中， AT-5菌株的生物強化處理對阿特拉津的去除率在7天時達到95.9% ，先前的研究曾表明，在節(jié)桿菌屬HB-5菌株處理的阿特拉津污染的土壤中，阿特拉津在土壤中的半衰期顯著降低至6.3天，結(jié)合我們的研究結(jié)果表明， AT-5菌株在土壤中具有極好的阿特拉津降解潛力。 此外，成功的生物強化不僅依賴于接種物的降解性，還依賴于其在環(huán)境中存活的能力。一些研究證明，接種物在環(huán)境中的持續(xù)存在是生物強化的關鍵因素。我們前期研究表明，接種的外源降解菌株在土壤中不能很好地存活，導致毒死蜱礦化率的下降。通過qRT-PCR和16S rRNA-擴增子測序，我們發(fā)現(xiàn)接種的 AT-5菌株在土壤中存活良好，并在14天的培養(yǎng)期內(nèi)保持相對穩(wěn)定，這保證了其對阿特拉津污染土壤的有效降解效率 。此外，生物修復往往受到環(huán)境的限制，如土壤類型等。而 AT-5菌株在包括中國濟寧、廊坊、徐州等在內(nèi)的多地區(qū)采集的不同土壤中表現(xiàn)出良好的修復效果 （補充圖S3、S4），這表明 AT-5菌株對阿特拉津污染的不同類型的土壤具有很大的修復潛力。

本研究中，放線菌門和變形菌門是所有處理組中最豐富的細菌門。以往的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門由于對污染物具有良好的耐受性，是各種農(nóng)藥污染土壤中的優(yōu)勢微生物。此外，在放線菌門和變形菌門中發(fā)現(xiàn)了幾種阿特拉津降解細菌，如節(jié)桿菌屬 Paenarthrobacter 、假單胞菌屬（ Pseudomonas ）和諾卡氏菌屬。與對照處理相比， 接種處理中芽孢桿菌的豐度顯著增加，表明潛在的土著芽孢桿菌可能直接或間接參與了阿特拉津的降解。 到目前為止，已報道幾種芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌ATLJ-5（ Bacillus licheniformis  ATLJ-5）、巨大芽孢桿菌ATLJ-11（ Bacillus megaterium   ATLJ-11）和枯草芽孢桿菌HB-6（ Bacillus subtilis  HB-6）均能夠降解阿特拉津及其代謝物。因此， 加入阿特拉津增加了潛在生物標志物（如芽孢桿菌）的相對豐度，其可能參與阿特拉津或其代謝物的生物降解過程。

接種處理中的細菌豐富度和多樣性顯著下降，在受啶蟲脒污染的土壤中接種 Pigmentiphaga sp. D-2菌株以進行生物強化過程的研究中也觀察到這一現(xiàn)象。本研究中觀察到的這種現(xiàn)象可歸因于AT-5菌株的持續(xù)存在和生態(tài)位占據(jù)。此外，接種AT-5菌株可增強阿特拉津的降解、中間產(chǎn)物的產(chǎn)生以及土壤中的養(yǎng)分消耗。這些土壤微環(huán)境的這些變化也可能導致細菌豐富度和多樣性的顯著降低。而對照處理（施加甲醇和ddH ₂ O）和Atr處理（施加阿特拉津）下的土壤樣本的豐富度和多樣性指數(shù)并未引起顯著的變化。這些結(jié)果表明， 本研究所接種的AT-5菌株主導了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化。 有研究表明，接種物在消除掉土壤中的污染物后其豐度會降低。考慮到土壤中復雜環(huán)境因素的影響以及接種物與土著微生物之間的競爭，我們推測菌株AT-5在消除阿特拉津后可能無法在原位土壤中保持較高的豐度。但本研究目前尚未在更長的時間尺度上收集Atr-Bio處理的土壤樣本。因此，在今后的研究中需要明確菌株AT-5在土壤中的最終命運。

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