不同基質(zhì)之間添加碳的礦化作用在存在差異（圖1），但在第7天和第21天，凋落物處理對(duì)添加碳的礦化影響不顯著（雙向方差分析）: 基質(zhì)，F(xiàn) _3,24  = 145.0, p  < 0.01；凋落物處理，F(xiàn) _2,24  = 2.8, p  = 0.08；交互作用，F(xiàn) _6,24  = 1.4, p  = 0.27），第21天（底物，F(xiàn) _3,24  = 69.1, p  < 0.01；凋落物處理，F(xiàn) _2,24  = 2.9, p  = 0.08；交互作用F _6,24  = 0.9, p  = 0.27）。氨基酸和葡萄糖也遵循類似的模式，約25%的添加基質(zhì)碳在第一周被礦化，只有少量的額外量（<4%）在第7天到21天之間被礦化。培養(yǎng)初期脂質(zhì)分解速度較快，但累積碳礦化量較低，僅占21 d后添加碳底物的3%左右。隨著時(shí)間的推移，纖維素的分解更加穩(wěn)定，約3%的碳在7天后礦化，約13%在21天后礦化。根據(jù)碳礦化動(dòng)力學(xué)，對(duì)第21天采集的纖維素和第7天采集的其他基質(zhì)的土壤樣品進(jìn)行了分子分析（更多細(xì)節(jié)請(qǐng)參見文章“材料與方法”部分）。

圖1 第7天和21天添加到來自對(duì)照組C、雙凋落物D和無凋落物N處理組土壤中的富含 ¹³ C基質(zhì)的累積碳礦化數(shù)值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

微生物群落（圖S1）以變形菌門 Proteobacteria （序列數(shù)占16S rRNA基因序列的29%-49%）和酸桿菌門 Acidobacteria （25%-40%）為主，此外疣微菌門 Verrucomicrobia （~8%）、浮霉菌門 Planctomycetes （~6%）、放線菌門 Actinobacteria （~3%）、擬桿菌門 Bacteroidetes （~3%）、 AD3 菌（~3%）、綠彎菌門 Chloroflexi （~2%）和厚壁菌門 Firmicutes （~1.4%）也占有一定比例。 微生物群落組成對(duì)凋落物處理和基質(zhì)變化的響應(yīng)不大 （圖2A；置換多變量方差分析（PerMANOVA）: 底物，pF _4,30  = 3.4, R ²  = 0.23, p  < 0.01; 凋落物處理pF _2,30  = 4.7, R ²  = 0.16, p  < 0.01; 交互作用pF _8,30  = 0.6, R ²  = 0.08, p  > 0.99）。少數(shù)細(xì)菌科的相對(duì)豐度在不同凋落物處理間存在差異（表S2）；例如，雙凋落物中酸桿菌科相對(duì)豐度升高，無凋落物中桿菌科和鞘單胞菌科相對(duì)豐度升高，對(duì)照中慢生根瘤菌科相對(duì)豐度升高。幾個(gè)科的相對(duì)豐度隨著底物的添加而發(fā)生變化（表S2），最顯著的是蛭弧菌科、伯克霍爾德菌科和微球菌科的相對(duì)豐度隨著葡萄糖的添加而增加大約2 - 5倍，隨著氨基酸的添加而增加大約4-15倍。纖維素使柄桿菌科和噬纖維菌科的相對(duì)豐度增加了2 ~3倍，脂類使莫拉氏菌科的相對(duì)豐度增加了3倍。

圖2 利用Bray-Curtis相異性評(píng)價(jià)基質(zhì)添加和凋落物處理對(duì)細(xì)菌群落組成（A）和相對(duì)碳同化率（B）的影響。培養(yǎng)前（T ₀ ）和培養(yǎng)1周（T ₇ ）添加底物時(shí)，對(duì)所有底物進(jìn)行群落組成計(jì)算，纖維素在培養(yǎng)3周（T ₂₁ ）后進(jìn)行分析。

類似于礦化結(jié)果（圖1），凋落物處理沒有影響所添加基質(zhì)相對(duì)碳同化率的整體模式（采用qSIP技術(shù)測(cè)定），但在所添加的基質(zhì)之間存在顯著差異（圖2B，PerMANOVA:基質(zhì), pF _{3, 22}  = 9.6, R ²  = 0.49, p  < 0.01;凋落物處理，pF _2,22  = 1.0, R ²  = 0.03, p  = 0.38；相互作用，pF _6,22  = 0.9, R ²  = 0.10, p  = 0.53）。氨基酸的平均相對(duì)碳同化率（圖S2）最大，為0.109（每7天），其次是葡萄糖:0.053（每7天），纖維素:0.037（每7天）和脂類:0.027（每7天）。氨基酸是最廣泛使用的底物，有402種（77%）觀察到的同化底物的系統(tǒng)發(fā)育類型（圖3A）。葡萄糖也被大量系統(tǒng)發(fā)育類型同化（176,33%），而吸收纖維素（68,13%）和脂類（37,7%）的系統(tǒng)發(fā)育類型相對(duì)較少。

添加4種底物的細(xì)菌相對(duì)碳同化率均表現(xiàn)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)（Pagel’s λ， p <0.05）；然而，這些信號(hào)的強(qiáng)度在不同的基質(zhì)上有所不同（圖3C，表S3）。根據(jù)Pagel等人提出的λ評(píng)估， 系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)在0到1之間變化，強(qiáng)信號(hào)（接近1）表明性狀值在相關(guān)物種間的數(shù)量分布與布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)化模型下的預(yù)期相似。 較低的特征值表明系統(tǒng)發(fā)育保守性較弱，且系統(tǒng)發(fā)育種的特征值分布更為隨機(jī)。氨基酸和脂質(zhì)的相對(duì)碳同化率的信號(hào)最強(qiáng)，而纖維素的信號(hào)明顯較弱，葡萄糖的信號(hào)居中。當(dāng)考慮底物在系統(tǒng)發(fā)育分支內(nèi)碳同化的保存程度時(shí)，系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)出現(xiàn)了類似的模式（圖3B，表S3）。氨基酸的相對(duì)碳同化率最大，其次是脂質(zhì)、葡萄糖和纖維素。

為了確定哪些分類群對(duì)基質(zhì)的碳同化影響最大，本研究根據(jù)分類群的相對(duì)豐度和相對(duì)碳同化率估算了不同細(xì)菌科吸收碳的比例（圖4）。與我們對(duì)系統(tǒng)類型的分析一致（圖3A），相對(duì)于纖維素和脂質(zhì)，更多的細(xì)菌科對(duì)氨基酸和葡萄糖的同化很重要。對(duì)于每種基質(zhì)，一個(gè)科吸收了超過25%的添加碳，伯克霍爾德科吸收了氨基酸和葡萄糖，噬細(xì)胞菌科吸收了纖維素，草酸桿菌科吸收了脂質(zhì)。

為了進(jìn)一步描述這些性狀的系統(tǒng)發(fā)育組織，我們估算了每種底物的相對(duì)碳同化率的祖先特征性狀（圖5）。這一分析強(qiáng)調(diào)了 能夠輕易同化每一種基質(zhì)的分支，這是通過共同祖先相對(duì)碳同化率的提高來反映。 例如， Betaproteobacteria 最近的共同祖先的氨基酸相對(duì)碳同化率（每7天）為0.315，遠(yuǎn)高于群落平均水平（0.109）。類似地，食胞菌科最新共同祖先的估計(jì)值比纖維素同化的群落平均值高約6.5倍。

圖4 吸收底物并占總吸收的至少1%細(xì)菌科基質(zhì)衍生碳同化平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顏色表示各細(xì)菌科的相對(duì)豐度大小和相對(duì)碳同化比率。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹展示了氨基酸（A）、葡萄糖（B）、纖維素（C）和脂類（D）的相對(duì)碳同化速率。不同的顏色表示觀察到的頂端類群和計(jì)算的祖先特征狀態(tài)節(jié)點(diǎn)的速率，注意不同的時(shí)間尺度。

細(xì)菌功能特性中的系統(tǒng)發(fā)育組織有助于解決微生物組的巨大多樣性，并更好地將群落組成與微生物介導(dǎo)的生態(tài)系統(tǒng)過程（如分解過程）中的功能聯(lián)系起來。在本研究中，我們觀察了土壤中不同化學(xué)基質(zhì)的細(xì)菌的相對(duì)碳同化率的系統(tǒng)發(fā)育組織。采用長(zhǎng)期森林試驗(yàn)的土壤，我們發(fā)現(xiàn)凋落物輸入對(duì)基質(zhì)同化沒有影響。相比之下，在實(shí)驗(yàn)性的添加到土壤中的基質(zhì)之間，和在同化微生物類群的數(shù)量和多樣性以及系統(tǒng)發(fā)育組織的強(qiáng)度方面，存在顯著差異。

盡管經(jīng)過了超過25年的處理，凋落物處理組僅對(duì)土壤特征（表S1）和細(xì)菌多樣性（圖2A）造成輕微變化。同時(shí)，未觀察到對(duì)基質(zhì)同化（圖2B）或礦化（圖1）的顯著影響。這些發(fā)現(xiàn)與其他研究相矛盾，這些研究表明， 歷史上的凋落物輸入可以影響微生物群落組成以及對(duì)當(dāng)前輸入的反應(yīng)。 凋落物組成的差異（例如松木凋落物與闊葉木凋落物）對(duì)于確定微生物數(shù)量尤其重要。雖然森林土壤實(shí)驗(yàn)改變了凋落物的數(shù)量，但組成基本上沒有變化，這可能解釋了本研究中微生物對(duì)凋落物處理的不明顯差異。該結(jié)果與其他森林土壤實(shí)驗(yàn)的研究一致，先前的研究表明， 添加20年凋落物對(duì)土壤總碳含量或礦層的輕組分碳沒有顯著影響。 類似地，Wang等人在泥土森林中的研究發(fā)現(xiàn)，在凋落物處理過程中，礦質(zhì)土壤中植物碳生物標(biāo)記物的濃度沒有顯著差異，這表明地上凋落物輸入對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)OM的組成和微生物生物量的影響較小。綜上所述，本研究的結(jié)果表明， 土壤細(xì)菌可能對(duì)凋落物輸入的變化具有抵抗力，這可能是由于Georgiou等人所述的群落水平調(diào)節(jié)過程，或依賴于根源性輸入。 最近的幾項(xiàng)研究表明，根源碳輸入可能是土壤碳儲(chǔ)存和微生物功能的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，尤其是對(duì)細(xì)菌而言。

我們觀察到不同基質(zhì)間礦化和土壤細(xì)菌同化方面存在很大差異。與我們的預(yù)期一致，氨基酸和葡萄糖被一系列不同的微生物系統(tǒng)發(fā)育類型迅速礦化同化，而纖維素和脂質(zhì)的礦化較慢（圖1），被相對(duì)較少的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育類型同化（圖3-5）。在所有基質(zhì)中，細(xì)菌對(duì)氨基酸的使用最為廣泛（圖3A），并且具有最高的相對(duì)碳同化率（圖S2），這表明氨基酸是土壤細(xì)菌最喜歡的基質(zhì)，比葡萄糖更容易用于生物量生產(chǎn)。這與過去的SIP研究結(jié)果一致，包括在水生系統(tǒng)中，多種浮游細(xì)菌的氨基酸中比從葡萄糖中更富含 ¹³ C。這也與森林土壤的實(shí)驗(yàn)一致，在該實(shí)驗(yàn)中，研究了蛋白質(zhì)、脂類和多糖分解過程中微生物群落的演替。

細(xì)菌的相對(duì)碳同化率呈現(xiàn)出四種底物的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)；然而，與葡萄糖和纖維素相比，氨基酸和脂質(zhì)的碳同化受進(jìn)化史的影響更大（圖3）。這與Goldfarb等人的研究結(jié)果一致，該研究報(bào)道了活性生物體在添加不穩(wěn)定碳（即蔗糖、甘氨酸）而非纖維素后的系統(tǒng)發(fā)育聚類。然而，這些趨勢(shì)與我們的假設(shè)相反，即葡萄糖和氨基酸的同化比纖維素和脂質(zhì)具有更弱的系統(tǒng)發(fā)育組織；似乎與特征基因組復(fù)雜性驅(qū)動(dòng)特征保守性的假設(shè)相沖突。然而， 在自然群落中，除了直接參與底物分解代謝的基因和相關(guān)表型外，特定底物可能涉及整套基因和相關(guān)表型。 這些潛在驅(qū)動(dòng)因素的垂直遺傳程度可能會(huì)影響觀察到的系統(tǒng)發(fā)育組織。例如，噬纖維菌科具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)性，這可能使它們能夠接觸不溶性纖維素，并在本研究（圖5）和其他研究中有效吸收這種碳源。對(duì)于高生物利用度和廣泛利用的底物，如氨基酸和葡萄糖，競(jìng)爭(zhēng)成功的決定因素是底物親和力和生長(zhǎng)速率，可能是同化過程的驅(qū)動(dòng)模式。事實(shí)上，葡萄糖同化率與土壤群落的生長(zhǎng)率密切相關(guān)。在不同的資源條件下，生長(zhǎng)率的遺傳決定因素是復(fù)雜的，并可能支持過去研究中觀察到的生長(zhǎng)率系統(tǒng)發(fā)育組織，以及在當(dāng)前研究中觀察到的氨基酸和葡萄糖同化率的系統(tǒng)發(fā)育組織（圖3）。

為了將微生物的特性與其在生態(tài)系統(tǒng)中的功能聯(lián)系起來，我們成功地確定了對(duì)處理土壤有機(jī)質(zhì)中存在的基質(zhì)非常重要的細(xì)菌家族（圖4）。許多對(duì)氨基酸碳同化有影響的家族對(duì)葡萄糖碳同化也有影響。最值得注意的是，伯克霍爾德菌科有較高的相對(duì)碳同化率，隨葡萄糖和氨基酸相對(duì)豐度的增加而增加，其所同化的碳約占氨基酸和葡萄糖碳同化的三分之一。除了伯克霍爾德菌科，伯克霍爾德菌科的另外兩個(gè)科， Comamonadacea 和 Oxalobac teraceae 是同化葡萄糖和氨基酸的重要細(xì)菌。伯克霍爾德菌科包含了跟多植物和真菌共生體。類似地， Comamonadaceae 和草酸桿菌科的成員與土壤根際作用有關(guān)，包含了一些促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌。因此，這些家族的成員可能已經(jīng)適應(yīng)了對(duì)根系分泌物競(jìng)爭(zhēng)和同化，如葡萄糖和氨基酸。伯克霍爾德氏菌科可能具有一定競(jìng)爭(zhēng)力，因?yàn)樗哂卸鄰?fù)制子基因組，進(jìn)而使其具有高增長(zhǎng)率。其他幾個(gè)科對(duì)這兩種基質(zhì)都很重要（如華桿菌科、 Pse Udomonadace 和酸桿菌科），其中一些細(xì)菌的相對(duì)豐度也隨著氨基酸和葡萄糖（微球菌科和蛭弧菌科）含量的增加而增加。然而，一些家族對(duì)氨基酸（如 Koribacteraceae 和 Usophaececeraceae ）的作用是獨(dú)特的，而其他家族對(duì)葡萄糖的作用是獨(dú)特的（例如放線菌目中未分類的細(xì)菌科和 Ellin329 ）。

從纖維素和脂類中吸收的碳大部分集中在幾個(gè)細(xì)菌科中。這些脂質(zhì)主要被 β 變形菌（草桿菌科和 Comamonadaceae ）和γ變形菌（ Moraxeleceae 和 Pseudomonada ）所同化。添加脂質(zhì)后，莫拉氏菌科的相對(duì)豐度增加。研究發(fā)現(xiàn)，這些家族的成員在土壤碳?xì)浠衔锝到鈺r(shí)相對(duì)豐度有所增加。事實(shí)上，添加脂肪酸可以在純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中模擬一些莫拉氏菌的生長(zhǎng)。脂肪酸降解通過β氧化發(fā)生，需要多種基因和酶。在γ變形菌中，脂肪酸的β氧化過程用于能量或磷脂的合成。這種磷脂合成的節(jié)能適應(yīng)性在革蘭氏陽性細(xì)菌中不存在，在本研究中，可能有益于莫拉氏菌科的成員。草酸桿菌科和 Comamonadaceae 中的大多數(shù)成員都是運(yùn)動(dòng)的，這可能使它們能夠獲得低溶解度的脂質(zhì)。我們的結(jié)果表明， 與脂質(zhì)生長(zhǎng)相關(guān)的性狀表現(xiàn)出強(qiáng)大的系統(tǒng)發(fā)育組織 （圖3B，C）。就纖維素而言，噬纖維菌科是最具影響力的菌群，占碳同化的近40%，其次是其他科，包括鞘氨桿菌科、鞘脂桿菌科、柄桿菌科和 Comamonadacea 。其中兩個(gè)科，噬纖維菌科和鞘脂桿菌科在添加纖維素后相對(duì)豐度有所增加。這些家族的成員是已知的纖維素降解物，并在過去的土壤 ¹³ C標(biāo)記的纖維素SIP試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。然而，這些細(xì)菌的纖維素分解機(jī)制卻不同。噬纖維菌科有新的纖維素消化酶，它們與膜結(jié)合，這不同于將纖維素酶和木聚糖酶分泌到溶液中的 Comamonadacea 科成員。這些不同的機(jī)制可以反映趨同進(jìn)化，解釋觀察到的纖維素同化相對(duì)較弱的系統(tǒng)發(fā)育組織（圖3B，C）。

正如所有基于SIP技術(shù)的微生物功能研究一樣，同位素轉(zhuǎn)換是有潛力的，其中， 生物體DNA不是通過直接同化添加的 ¹³ C底物，而是通過攝取由富含 ¹³ C的底物的直接同化物產(chǎn)生的化合物（例如代謝物、壞死物質(zhì)、胞外分泌物等）來進(jìn)行同位素標(biāo)記。 鑒于我們確定的許多分類群對(duì)每種基質(zhì)都很重要，與過去的研究一致，大多數(shù)確定的分類群可能是基質(zhì)的直接同化物。然而，一些細(xì)菌科可能通過同位素轉(zhuǎn)換被貼上標(biāo)簽，至少部分是這樣。已知含有運(yùn)動(dòng)專性捕食細(xì)菌的噬菌弧菌亞科和蛭弧菌亞科在多種基質(zhì)中具有較高的相對(duì)碳同化率（圖4）。在基于qSIP的實(shí)驗(yàn)中，捕食性細(xì)菌往往表現(xiàn)出比非捕食性細(xì)菌更高的同位素富集水平。這表明這些群體（蛭弧菌和類似生物： BALOs ）可能更喜歡積極的捕食性增長(zhǎng)，在這種情況下，捕食者會(huì)利用添加的基質(zhì)進(jìn)行生物量生產(chǎn)。雖然證據(jù)有限，但 BALOs 的生態(tài)過程似乎與其系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，這表明這些群體的特征可能特別適合基于系統(tǒng)發(fā)育的預(yù)測(cè)。

我們的結(jié)果表明， 可以估計(jì)與分解作用相關(guān)的重要微生物性狀的祖先特征狀態(tài) （圖5）。這為基于系統(tǒng)發(fā)育的預(yù)測(cè)（也稱為系統(tǒng)發(fā)育建模）奠定了基礎(chǔ)，使用祖先特征估計(jì)來預(yù)測(cè)相關(guān)微生物物種未觀察到的特征值。對(duì)于大型有機(jī)體，該方法可靠地預(yù)測(cè)了許多不同的特征，例如即使在群落中具有未觀察到的特征的分類群占多數(shù)的情況下，食肉動(dòng)物的體重和壽命以及魚類的營(yíng)養(yǎng)成分依然可被預(yù)測(cè)。在大型生物中，系統(tǒng)發(fā)育模型的實(shí)際應(yīng)用還包括從通常觀察到的近親預(yù)測(cè)非常稀有、瀕危兩棲動(dòng)物的特征，以及預(yù)測(cè)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中木本植物對(duì)草食性動(dòng)物破壞的易感性。利用系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系預(yù)測(cè)微生物特征的一個(gè)挑戰(zhàn)是水平基因遷移。然而，絕大多數(shù)微生物基因是垂直轉(zhuǎn)移的。進(jìn)一步分析原核生物的基因組和表型特征（在純培養(yǎng)中評(píng)估）發(fā)現(xiàn)，98%的二元特征和74%的連續(xù)特征具有顯著的系統(tǒng)發(fā)育組織。迄今為止，微生物特征的祖先重建僅限于使用基因組參考數(shù)據(jù)庫來估計(jì)基因拷貝數(shù)。我們的方法大大擴(kuò)展了祖先特征分析的潛在應(yīng)用范圍，使我們能夠超越代表功能潛力的遺傳特征，并利用表型功能特征的原位定量測(cè)量。這對(duì)于預(yù)測(cè)土壤中細(xì)菌的功能特性尤其有用， 因?yàn)橥寥乐屑?xì)菌的高度多樣性，再加上原位測(cè)量功能特性的方法學(xué)挑戰(zhàn)，使得對(duì)大多數(shù)微生物類群的特性進(jìn)行編碼變得不可行。 相比之下，基于系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記的生物多樣性調(diào)查既便宜又常見。需要進(jìn)行更多的研究，以確定這些調(diào)查是否可以與基于系統(tǒng)發(fā)育的預(yù)測(cè)相結(jié)合，從而為基于特征的生態(tài)系統(tǒng)功能模型提供信息。由于本研究利用了一組有限的純基質(zhì)，不包括土壤中有機(jī)質(zhì)的多樣性，因此這項(xiàng)工作應(yīng)被視為理解土壤有機(jī)質(zhì)分解的系統(tǒng)發(fā)育控制的第一步。

土壤中含有各種各樣的有機(jī)基質(zhì)和微生物種類，這兩種物質(zhì)都導(dǎo)致了土壤有機(jī)質(zhì)分解的復(fù)雜性。本研究結(jié)果表明， 自然群落中的微生物在同化底物時(shí)具有系統(tǒng)發(fā)育組織。 具體而言，對(duì)于許多細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育類型（氨基酸和葡萄糖）使用的快速礦化基質(zhì)，以及更受限制的細(xì)菌群（纖維素和脂質(zhì)）使用的逐漸分解的化合物，都觀察到了系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)。利用微生物基質(zhì)同化中的系統(tǒng)發(fā)育組織可以幫助我們解決土壤有機(jī)質(zhì)分解的復(fù)雜生物控制問題，以便更好地理解和預(yù)測(cè)變化世界中的碳通量。