建立合適的HPLC分析方法，你需要……
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上周，我們“分不開(kāi)怎么辦”欄目收到了一位王同學(xué)的咨詢，她在 人參皂苷類(lèi)化合物分析 方面遇到了一些困難：
1. 使用T家C18柱，Rg1和Re未實(shí)現(xiàn)基線分離（分離度R<1.5）；
2. 更換色譜柱為A家C18，在相同條件下，同樣未實(shí)現(xiàn)Rg1和Re的基線分離；
3. 在A家C18色譜柱的基礎(chǔ)上，調(diào)整流動(dòng)相梯度，Rg1和Re可以滿足基線分離，但是其他人參皂苷（Rb1、Rb2、Rc和Rd）分離不理想。
王同學(xué)的訴求是 尋找一個(gè)合適的HPLC分析方法（包括色譜柱和流動(dòng)相），能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中所有人參皂苷的良好分離 （ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1）。
收到問(wèn)題后，我們的“大師兄”團(tuán)隊(duì)立即聯(lián)系了王同學(xué)，針對(duì)她的訴求提出了一些建議。
王同學(xué)的這個(gè)案例很有代表性，因此今天我們就以這個(gè)案例為例，和大家 分享一下在做HPLC分析方法開(kāi)發(fā)時(shí)的思路和心得 。
通常來(lái)說(shuō)，建立合適的HPLC分析方法，你需要：
確定分離目標(biāo)，明確方法要求；
解析目標(biāo)分析物，包括化合物結(jié)構(gòu)、分子量、吸收光譜、pKa和化學(xué)穩(wěn)定性等方面信息；
對(duì)收集到的信息進(jìn)行綜合分析和考慮，選擇合適的色譜柱（固定相），設(shè)計(jì)合適的實(shí)驗(yàn)條件；
使用挑選的色譜柱和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析，根據(jù)結(jié)果調(diào)整色譜柱和實(shí)驗(yàn)條件；
在合適的色譜柱和實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，最終得到穩(wěn)定靠譜的實(shí)驗(yàn)方法。
針對(duì)今天的案例，我們一條條看：
首先，我們明確這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)合適的 HPLC方法 實(shí)現(xiàn) 人參皂苷化合物 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1 的分離 。
建立合適的人參皂苷HPLC分析方法，需要進(jìn)行全方位的考慮，其中 化合物結(jié)構(gòu) 是至關(guān)重要的點(diǎn)。
人參皂苷（ Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等 ）是人參的主要成分，都具有相似的基本結(jié)構(gòu)： 含有由30個(gè)碳原子排列成四個(gè)環(huán)的甾烷類(lèi)固醇核。
它們都具備以下特點(diǎn)：
1. 化合物 偏中性 ，具備一定的 疏水性 ；
2. 不同化合物之間的差異在于糖分子的種類(lèi)和數(shù)量， 結(jié)構(gòu)比較接近 ，甚至屬于同分異構(gòu)體；
3. 分子量在800-1200， 分子結(jié)構(gòu)偏大 （小分子領(lǐng)域）。
根據(jù)人參皂苷化合物的這些特點(diǎn)，我們確定了建立HPLC方法的要點(diǎn)：
1. 偏中性化合物， 流動(dòng)相 可以采用非緩沖的 水溶液 ，甚至純水相；
2. 具備一定疏水性的結(jié)構(gòu)相近化合物，色譜柱考慮采用 C18固定相 ，使用 等度或緩梯度 ；
3. 分子物理尺寸偏大， 孔徑 在分離中有可能發(fā)揮重要作用，需要仔細(xì)考察此點(diǎn)。
2020版中國(guó)藥典人參的含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定的色譜柱： 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 。
但是中國(guó)藥典方法中并沒(méi)有明確色譜柱的細(xì)節(jié)，包括色譜柱規(guī)格、固定相粒徑和孔徑，而這些往往會(huì)影響分離效果。
我們先按照該方法，使用相同規(guī)格的不同孔徑ChromCore 120 C18（120 ?）和ChromCore C18 （180 ?）對(duì)人參皂苷Rg1和Re進(jìn)行分析，得到如下結(jié)果：
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在藥典人參方法下，人參皂苷Rg1和Re在ChromCore 120 C18（120 ?）和ChromCore C18 （180 ?）上都能獲得良好的峰型，在ChromCore C18 （180 ?）獲得更好的分離度（R>2.0），滿足藥典要求。
ChromCore 120 C18（120 ?）和ChromCore C18 （180 ?）兩款色譜柱采用相同的硅膠基質(zhì)和鍵合工藝， 主要差別在于孔徑 。
另外，2020版中國(guó)藥典西洋參的含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定的色譜柱： 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 。
我們?cè)侔凑赵摲椒ǎ褂孟嗤?guī)格的不同孔徑ChromCore C18（180 ?）和ChromCore 300 C18 （300 ?）對(duì)人參皂苷Rg1和Re進(jìn)行分析（兩種人參皂苷在ChromCore 120 C18上共流出，譜圖未放）：
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在藥典西洋參方法下，人參皂苷Rg1和Re在ChromCore C18（180 ?）未獲得基線分離，而在ChromCore 300 C18 （300 ?）獲得更好的分離度，完全滿足藥典要求。
西洋參方法中梯度斜率高于人參方法（梯度更陡），因此人參方法適用的ChromCore C18（180 ?）在西洋參方法下，無(wú)法實(shí)現(xiàn)Rg1和Re的基線分離。
由此可見(jiàn)，在分離分子 尺寸較大且結(jié)構(gòu)相似 的化合物時(shí)，不僅要選用合適的固定相官能團(tuán)，更要 注意固定相基質(zhì)孔徑的選擇 ，以達(dá)到最佳的分離效果。
經(jīng)過(guò)上面實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，最后我們選用ChromCore 300 C18 （300 ?），在中國(guó)藥典人參方法下，對(duì)7種人參皂苷進(jìn)行分析：
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由以上譜圖可知，7種人參皂苷在ChromCore 300 C18 （300 ?）上都能獲得良好的峰型和分離，完全滿足HPLC定性和定量要求。
也就是說(shuō)，在人參皂苷等 物理尺寸較大 的化合物HPLC分析中， 大孔徑固定相色譜柱有利于結(jié)構(gòu)相近組分的分離 。
希望今天這個(gè)案例的梳理，能夠?qū)δ愕腍PLC分析方法開(kāi)發(fā)工作有所啟發(fā)和幫助。
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