真的假的？構(gòu)建質(zhì)粒這些知道的越少，成功率越高
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ShengWuXueBa
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新手質(zhì)粒構(gòu)建，總會(huì)遇到五花八門的問題：酶切后跑膠條帶彌散、酶切后跑膠有多余條帶、酶切不完全、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)連上的不是正確的目的基因...... （文末可免費(fèi)領(lǐng)取禮品哦）
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然而一問身邊構(gòu)建厲害的人，人家早就避開這些坑了，導(dǎo)師群里詢問兩個(gè)月構(gòu)建載體進(jìn)展時(shí)，我只能厚著臉皮說，好消息：又見多識(shí)廣了，壞消息：是陰性結(jié)果！當(dāng)我把跑膠圖發(fā)給導(dǎo)師后，導(dǎo)師頭也不回的退出群聊……
別慌！今天學(xué)霸君給大家整理了 常見載體構(gòu)建問題踩坑的原因 ，希望你經(jīng)歷的越少越好，如果實(shí)在犯了錯(cuò)，也可以補(bǔ)救回來。
酶切后 DNA 瓊脂糖凝膠電泳彌散狀
可能原因 1：內(nèi)切酶與底物 DNA 結(jié)合
解決方法： 降低使用的酶量；向上樣緩沖液中加入 SDS（0.1～0.5%）以分離酶與 DNA。
可能原因 2：核酸酶污染
解決方法： 使用新配制的無污染的電泳緩沖液；使用新配制的瓊脂糖凝膠；對(duì) DNA 進(jìn)行純化。
酶切不完全
可能原因 1：鹽的抑制
解決方法： 在含有鹽的緩沖液中活性低的酶，可能是對(duì)鹽敏感，可在酶切前先純化 DNA；使用離心柱的 DNA 純化方法可能會(huì)造成高鹽離子水平，從而抑制酶活性，要避免該情況發(fā)生，DNA 溶液體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的 25%。
可能原因 2：PCR 組分的抑制
解決方法： 在進(jìn)行酶切前對(duì) PCR 片段進(jìn)行純化。
可能原因 3：使用的酶量過少
解決方法： 每 μg 的 DNA 至少使用 3～5 單位的酶。
可能原因 4：DNA 被抑制劑污染
解決方法： 小量制備的 DNA 尤其容易受到污染物的影響，推薦使用質(zhì)量有保證的 DNA 純化試劑盒；或者增大反應(yīng)體系以稀釋污染物。
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膠中出現(xiàn)多余的條帶
可能原因 1：如果膠中發(fā)現(xiàn)比預(yù)期更大的條帶，這可能是由于酶與底物結(jié)合
解決方法： 降低反應(yīng)中的酶量；向上樣緩沖液中加入 SDS（0.1～0.5%）以分離酶與底物
可能原因 2：酶的星號(hào)活性
解決方法： 使用隨酶提供的推薦緩沖液；降低反應(yīng)中酶量，同時(shí)確保酶量不超過反應(yīng)總體積的 10%，這樣確保甘油總濃度不超過 5% v/v；減少反應(yīng)時(shí)間，使用完全酶切所需的最短反應(yīng)時(shí)間，以避免星號(hào)活性。
可能原因 3：內(nèi)切酶部分消化
解決方法： 在進(jìn)行酶切前先純化 PCR 片段，避免高鹽離子濃度對(duì)酶的活性造成影響；使用隨酶提供的推薦緩沖液；每 μg 的 DNA 至少使用 3～5 單位的酶；消化 DNA 1～2 小時(shí)。
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從常見問題的解決方法不難看出，保證限制性內(nèi)切酶正常發(fā)揮功能，可以避免很大一部分的陰性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)技巧和試劑兩手抓，一周搞定載體構(gòu)建不是夢(mèng)！實(shí)驗(yàn)試劑選擇優(yōu)質(zhì)大牌更靠譜，NEB一直致力于開發(fā)高純度和優(yōu)質(zhì)的限制性內(nèi)切酶，高穩(wěn)定、高保真。
正值 NEB 成立 50 周年慶， 4 月 1 日～30 日推出全線限制性內(nèi)切酶驚喜大促活動(dòng) ，做分子實(shí)驗(yàn)的小伙伴千萬(wàn)別錯(cuò)過占便宜的好機(jī)會(huì)！
活動(dòng)規(guī)則：
促銷期間，以 NEB 中國(guó)官網(wǎng)（www.neb.cn）2024 年目錄價(jià)購(gòu)買任意一支限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品（V 包裝除外），即可獲贈(zèng)一支相同產(chǎn)品（同貨號(hào)同包裝），多買多贈(zèng)。
注：本活動(dòng)僅適用于從 NEB 官方代理商渠道購(gòu)買產(chǎn)品的終端用戶。
NEB -限制性內(nèi)切酶開發(fā)與生產(chǎn)的先行者
50 年以來，NEB 一直致力于開發(fā)高純度和優(yōu)質(zhì)的限制性內(nèi)切酶，為科研工作者們提供優(yōu)質(zhì)的酶工具，贏得了酶領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者的美譽(yù)。
NEB 的科學(xué)家們不斷優(yōu)化現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品的性能，并積極探索這些酶在新技術(shù)領(lǐng)域的衍生應(yīng)用。他們持續(xù)根據(jù)研究成果發(fā)表科學(xué)論文，同時(shí)在該領(lǐng)域獲得了多項(xiàng)科研基金的支持。
作為限制性內(nèi)切酶領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)先的研究團(tuán)隊(duì)，NEB 是首家將重組酶商業(yè)化、研發(fā)出切刻內(nèi)切酶以及推出高保真（HF ? ）限制性內(nèi)切酶的企業(yè)。此外，NEB 始終走在創(chuàng)新前沿，不斷對(duì)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行基因工程改造，通過這項(xiàng)工作，內(nèi)切酶的品質(zhì)和特異性得到顯著的提升。
限制性內(nèi)切酶的歷史
每一次成功的實(shí)驗(yàn)都離不開優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的助力。NEB 作為科研領(lǐng)域的佼佼者，始終與您并肩前行，特意推出全線限制性內(nèi)切酶大促回饋，希望為大家的實(shí)驗(yàn)提供更多幫助，優(yōu)惠多多，不容錯(cuò)過～
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內(nèi)容策劃：潘成 內(nèi)容審核：吳軍
圖片來源：NEB
題圖來源：自己做的